仿生纳米颗粒酶递送系统的构建文献综述

 2022-12-29 02:12
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开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）

毕业论文开题报告

课题名称：仿生纳米颗粒酶递送系统的构建

  1. 课题的背景与目的
    1. 课题的背景

随着现代医学、药学等科学技术的飞速发展,人类跟肿瘤的斗争已经在很短的时间内取得了巨大的进展,人们也逐渐开始寻找新的“更优解”来更替原本主要的“伤敌一千，自损八百”的化疗与放疗手段，分子靶向药物治疗也就因运而生。与此同时，分子和纳米影像学在疾病的早期诊断和实时评价治疗的显著效果也更好的促使了不同手段联合治疗和免疫治疗的发展。纳米颗粒可以将不同手段和治疗功能集合一起，并通过其高通透、高滞留效应(即EPR效应)能够进入肿瘤组织深处,因而纳米颗粒在癌症诊疗领域中的应用十分广泛。但其在二次注射时会出现由于加速血液清除现象而导致效能降低。生物仿生技术则通过提取自体细胞膜成分包被纳米粒，不但可以大大增强纳米粒的生物相容性，同时还能延长纳米粒的血液循环时间。颗粒酶是由T淋巴细胞(CTLs)和自然杀伤细胞(NK)分泌的一种丝氨酸蛋白酶，能够通过不同的途径诱导靶细胞发生凋亡。目前在人体中已经发现5 种类型的颗粒酶，分别为颗粒酶A、B、H、K、M。有多篇文献报道颗粒酶B诱导癌细胞凋亡的能力最强，并且发挥作用的时间极短，进入癌细胞后能快速诱导癌细胞发生凋亡。而将颗粒酶B或颗粒酶B基因通过合适的载体递送进而发挥抗肿瘤作用成为新的研究热点。综上所述，本实验将利用仿生伪装的理念，构建巨噬细胞膜融合脂质体并包裹颗粒酶的递送系统。

    1. 课题研究的目的

能够熟练掌握实验操作步骤，能够成功提取巨噬细胞膜，成功将巨噬细胞膜与脂质体相融合，能够成功将颗粒酶包裹进入纳米脂质体中，成功构建包裹颗粒酶的生物仿生递送系统

  1. 实验与研究方法

1.巨噬细胞膜的提取和纯化

1.1实验材料

      1. 细胞

巨噬细胞

      1. 主要试剂

RPMI-1640 培养基、高糖DMEM培养基、胰蛋白酶、FBS、青霉素-链霉素混合液、DiI 、PBS 缓冲液、DAPI 染液

      1. 主要仪器

超净工作台、CO2 培养箱、台式离心机、高速冷冻型微量离心机、光学显微镜、倒置荧光显微镜、透射电子显微镜、纯水仪、荧光分光光度计、紫外分光光度计、电子天平、电泳设备、脱色摇床、恒温摇床、恒温水浴锅、-80℃冰箱、冷冻干燥机、超声细胞破碎仪、旋转蒸发仪、粒径分析仪

1.2实验方法

1.2.1细胞培养

培养永生化的巨噬细胞是收获作为巨噬细胞膜来源，巨噬细胞培养在含10% FBS、100U/m L青霉素-链霉素混合溶液的高糖 DMEM 培养基中,培养所用的血清需提前在 56℃水浴灭活30 min。

  1. 细胞复苏。

打开水浴锅，设置水温为 37 ℃；取细胞培养皿、离心管、移液枪等放于超净台内，紫外灯照射 30 min 消毒；取出液氮罐中的细胞对应冻存管，迅速转移至已加热好的37 ℃水浴锅内解冻；解冻好的细胞以1：9的比例与细胞培养基加入到离心管中800 r/min 转速离心3 min。弃去上清，加入10% FBS的高糖DMEM 培养基重悬细胞，将重悬好的细胞转移到培养皿内培养。

  1. 细胞传代。

显微镜下观察细胞密度约80%左右即采取传代操作；吸去培养基，以无菌PBS漂洗细胞；吸去PBS，加入4mL新鲜培养基，以细胞刮刀从一侧将细胞轻轻刮下（操作时注意动作轻柔，不能来回刮）用移液枪将培养基细胞悬液转移到离心管中，800 r/min离心3 min；轻柔吹打使细胞分散为单细胞，将细胞悬液转移至培养皿中，做好标记，放入细胞培养箱继续培养。

  1. 细胞冻存。

显微镜下观察处于对数生长期的状态较好的细胞长到80%细胞汇合度时可进行冻存操作；按上述方法将细胞从培养皿中分离下来，离心沉淀后以900mu;lLFBS重悬细胞，加入100mu;L细胞级DMSO作为冻存保护剂，重悬混匀；用移液枪将其转移至无菌冻存管内，封口胶封冻存管口，做好标记；将细胞冻存管装入细胞冻存盒内，置于-80℃冰箱过夜；细胞冻存管置于液氮罐内可长期保存。

  1. 收获细胞。

当细胞长到80%汇合度时，吸去培养基，加入预冷的Tris-magnesium缓冲液(TM buffer, pH 7.4, 0.01 M Tris and 0.001 M Mg Cl2)并加入1%体积的苯甲基磺酰氟（PMSF）防止蛋白降解，用细胞刮刀将细胞刮下800 r/min离心收集细胞悬液。

1.2.2巨噬细胞膜的提取与纯化

将收集的细胞悬液在冰上重悬，稀释到2.5times; 10^7个细胞/mL的浓度，TM buffer

加 1%体积的PMSF低渗孵育过夜。用不带有聚碳酸酯膜的脂质体挤出仪来回挤

20次收集的细胞悬液，通过机械挤压作用破坏细胞结构得到细胞匀浆，再往细胞匀浆中加1M的蔗糖溶液至终浓度为0.25M，于4℃、2000g条件下离心15 min，弃去沉淀收集上清，重复离心一次弃去尚未完全分离掉的细胞核细胞器等结构，将收集到的上清在 4℃、3000 g 条件下离心收集沉淀即为巨噬细胞膜。将收集到的巨噬细胞膜用冰 TM buffer 洗一遍后离心收集得到进一步纯化的巨噬细胞膜。

1.2.3验证膜成分

为验证提取出的是细胞膜且不含细胞核等其他成分，将培养好的细胞用DiI与DAPI 进行细胞膜与细胞核双染以区分提取出来的是膜成分或是核成分。取生长到 80%汇合度的细胞，弃去培养基，用无菌PBS 漂洗一遍，再用4%的多聚甲醛固定15 min，无菌PBS 漂洗两遍，10mu;M的细胞膜染色液DiI染15min，无菌PBS

漂洗两遍，最后用细胞核染色液DAPI 染色 15 min,PBS漂洗后再按1.2.2步骤提取细胞膜，在离心提纯步骤将提取物放在荧光显微镜下观察现象。

2.脂质体的制备

2.1空白脂质体的制备

精密称取一定量的脂质材料（胆固醇、磷脂和DSPE-PEG20002000）到干燥的250 mL圆底烧瓶中，加入15 mL三氯甲烷溶液。将其充分摇匀后置于水浴条件下超声15min，使原材料与溶剂能充分混匀。然后将溶液在一定温度下抽真空进行蒸发，完全蒸干有机溶剂后得到一层在烧瓶内壁附着的脂质材料薄膜。加入一定量的水化介质，通过磁力作用刮下脂质薄膜使其溶解于介质中，在一定温度下旋转孵育一段时间后，得到白色的乳浊液。最后将乳浊液置于超声波细胞粉碎机中粉碎后放置 4 ℃冰箱保存备用。

2.2空白脂质体制备的处方筛选

本实验将从脂质体制备的三要素方面进行单因素实验考察：（1）脂质材料的比例；（2）水化孵育的温度；（3）探超时间。粒径是判断脂质体是否符合要求的重要指标，分散系数（PDI）是判断脂质体的分散性是否良好的重要依据，PDI小于0.2 说明脂质体具有良好的分散性。因此将以粒径和PDI为指标来判断脂质体是否合格并筛选确定最优处方。

2.2.1磷脂和胆固醇比例对比实验

保持其他实验条件不变，探究脂质体成分中脂质材料比例的影响。实验中设计多个处方，分别将磷脂与胆固醇的摩尔比例设置为 6:1、5:1、4:1、3:1、2:1，按照上述的实验步骤分制备空白脂质体并分别对其粒径及PDI 进行分析对比。

2.2.2水化孵育温度对比实验

保持其他实验条件不变，探究制备过程中水化孵育温度的影响。实验中分别将水化孵育温度设置为 35℃、40℃、45℃、50℃、55℃。按照上述实验步骤制备空白脂质体并分别对其粒径及PDI进行分析对比。

2.2.3探超时间对比实验

保持其他实验条件不变，探究制备好的脂质体在不同的探超时间下的变化。实验中将粉碎仪的工作次数分别设置为 10次、20次、30次，即超声时间分别设置为 80s、160s、240s，将超声细胞粉碎仪的功率、间歇时间、工作时间分别设置定为 200 W、5s、3s。按照上述实验步骤制备空白脂质体并分别对其粒径及 PDI进行分析对比。

2.3载药脂质体的制备

精密称取一定量的脂质材料（胆固醇、磷脂和DSPE-PEG20002000）以及脂溶性药物加

入到干燥的250 mL圆底烧瓶中，加入15 mL三氯甲烷溶液。将其充分摇匀后置于

水浴条件下超声15min，使原材料与溶剂能充分混匀。然后将溶液在一定温度下抽

真空进行蒸发，完全蒸干有机溶剂后得到一层在烧瓶内壁附着的脂质材料薄膜。加

入一定量的水化介质，通过磁力作用刮下脂质薄膜使其溶解于介质中，在一定温度

下旋转孵育一段时间后，得到乳浊液。最后将乳浊液置于超声波细胞粉碎机中粉碎

后放置 4 ℃冰箱保存备用。

3.巨噬细胞膜-脂质体融合

将所制备得到的巨噬细胞膜终溶液与2.3中制得的载药脂质体依次通过400 nm、

200 nm的聚碳酸酯膜在脂质体挤压器上往复挤压40次，离心（3000 rpm，5 min）所得溶液，即获得巨噬细胞膜-脂质体。

4.药物含量的测定

4.1紫外可见吸收光谱波长的确定

避光条件下，配制适当浓度的药物的无水乙醇溶液和，置于紫外可见区（UV-vis，200~800nm）扫描，记录并保存其紫外可见吸收光谱并确定其最大吸收波长，同时观察特征峰的变化情况。

4.2 标准曲线的建立

避光条件下，使用容量瓶精确配置药物的的无水乙醇储备液（1 mg/m L），用无水乙醇依次稀释至梯度浓度：5、10、15、20、25、30、35、40 micro;g/mL，在吸收波长处测定相应的紫外吸光度 A，最后以药物的梯度浓度 C 为横坐标，吸光度 A 为纵坐标绘制出紫外吸收标准曲线图谱，利用所得数据建立其标准曲线。

4.3 包封率的测定

精密量取4m L的载药脂质体乳浊液置于透析袋（MW：8000~14000）中放入烧杯，同时在烧杯中加入 600 m L超纯水作为透析介质，使游离药物溶于超纯水中，搅拌一定时间后更换透析介质并进行 UV-vis 吸收光谱检测，直至透析介质中不再出现负载药物的吸收峰即视 为游离药物已完全除去。收集透析袋中已与游离药物完全分离的乳浊液，用2mL Trixton x-10混匀使其破乳。分别测定相应吸收波长处的吸光度A，根据4.2中所得线性标准曲线方程计算出破乳后的药物含量，即中包含的药物量。

包封率%=测得药物含量/原料药量x100%

5.脂质体的性质测定

5.1粒径分布与电位的测定

用激光纳米粒度仪来测定在常温下的包膜前后的脂质体的Size、PDI 与 Zeta 大小，每个样品重复测定3次取其平均值

5.2稳定性的测定

分别将包膜前后的空白脂质体分散在含 10%牛血清白蛋白的磷酸缓冲盐溶液中，分别于 0、2、4、8、10、12、24、48、72、96、120h 测定并观察粒径变化情况，以此作为稳定性的指标，每个样品重复测定 3 次取其平均值

6.巨噬细胞膜-脂质体-颗粒酶B（pGZMB）纳米粒的构建与测定

6.1巨噬细胞膜-脂质体-颗粒酶B（pGZMB）纳米粒的构建

精密称取适量巨噬细胞膜-脂质体，加蒸馏水配制成 10 mg /mL 的浓储液备用，临用前稀释到1125 mu;g /mL，固定pGZMB 的浓度为 100 mu;g /mL，并按巨噬细胞膜-脂质体与 pGZMB 质量比为 90∶ 8，90∶ 16，90∶ 32，90∶ 64，90∶ 128，90∶ 256，90∶ 512，90∶ 1024，90∶ 2048，90∶4096 依次将巨噬细胞膜-脂质体进行稀释，将 50 mu;L pGZMB 在低速涡旋下缓慢逐滴滴加到等体积的不同浓度的 bPEI 溶液中，室温静置孵育 30 min，得到不同质量比制备的巨噬细胞膜-脂质体-颗粒酶B纳米粒。

6.2 琼脂糖凝胶电泳考察pGZMB 的压缩能力

6.2.1 配制 5 times; TAE 电泳缓冲液

精密称取 Tris 2.42 g，Na2EDTA·H2O 0.372g，加冰乙酸 0.571 mL，用蒸馏水稀释至 100 mL备用，临用前需用蒸馏水稀释5倍。

6.2.2 琼脂糖凝胶的制备及使用

称取0.16 g琼脂糖于锥形瓶中，加入20 mL 1 times; TAE电泳缓冲液，加热至琼脂糖沸腾溶解，待冷却至50～65 ℃时加入2 mu;L Goldview(核酸染色剂)，轻轻混匀，然后将凝胶轻轻倒入插有梳子的水平槽内，冷却完全后，拔出梳子，将凝胶放入电泳槽内，外槽加满1 times; TAE( 约 100 mL) ，高于胶面 1～2 mm，预先将2 mu;L 6 times; Loading buffer加到 EP管中，分别取 10 mu;L不同压缩质量比的样品加入到上述 EP 管中混匀，分别取 10 mu;L上样，上样时不要产生气泡，加样时要防止样品溢出，将仪器电压设置为90 V，时间设置为20min。电泳结束后，将琼脂糖凝胶放入成像仪观察质粒的压缩情况。

6.2.3 巨噬细胞膜-脂质体-颗粒酶B纳米粒最优处方的筛选

制备不同质量比( 90 ∶ 1，90 ∶ 2，90 ∶ 4，90 ∶ 8，90 ∶ 16， 90∶ 32，90∶ 64，90∶ 128，90∶ 256，90∶ 512) 的纳米粒，分别用纳米粒度电位分析仪测定其Size、Zeta 电位，对处方进行优化。

6.2.4 巨噬细胞膜-脂质体-颗粒酶B纳米粒的粒径分布、电位及形态与上载检验

以巨噬细胞膜-脂质体-颗粒酶B最优质量比制备3批纳米粒，用纳米粒度电位分析仪测定其粒径及PDI、电位。通过透射电镜观察其形态: 用镊子夹一个铜网，将铜网浸入适宜浓度新鲜制备的纳米粒溶液中，静置10 s后取出，滴加一滴2%磷钨酸于铜网上，用滤纸轻轻吸去铜网上多余液体，然后将铜网放在洁净的滤纸上，在紫外灯下烤约半小时后置于透射电镜下观察其形态并拍照。

  1. 研究条件和可能存在的问题

实验室可以提供实验所需的实验仪器还有药品的需求，可能存在的问题是由于新冠病毒的影响，导致返校实验时间被压缩，可能会影响实验的完成进度。正式返校后抓紧时间展开实验，疫情期间多做文献的积累储备。以充分的准备完成论文、迎接答辩。

四、参考文献

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开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）

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