高效UDPG循环系统的构建文献综述

 2022-12-29 02:12
  1. 课题研究目的

糖基化修饰是改善药物或药物先导化合物水溶性、稳定性以及生物活性的重要手段之一。但是，化学法糖基化修饰的选择性极差，糖基转移酶成为化合物糖基化修饰的重要工具。UDPG依赖的糖基转移酶在化合物的立体选择性和位置特异性修饰中展现出巨大的潜力，不过外源性添加价格高昂的UDPG糖供体成为其工业化应用的主要局限。本课题拟采用UDPG依赖糖基转移酶偶联蔗糖合酶的循环反应，实现大肠杆菌内源性UDPG的再生，以避免外源性UDPG的添加，构建高效的UDPG循环系统，为糖基转移酶的应用提供工具。

  1. 研究方法
  2. 质粒、菌种及外源基因
  3. 蔗糖合酶为拟南芥AtSUS1基因；UDPG糖基转移酶为由罗汉果UGT94-289-2基因进行大肠杆菌密码子优化并进行194位氨基酸改造的GT-19 I194G突变体基因。
  4. 用于构建共表达的质粒是pETDuet-1，为双启动子质粒。因此共表达的AtSUS1基因和GT-19 I194G基因会存在转录前后顺序的不同，需要通过实验来验证，怎么插入时，反应的转化率更高。
  5. 所用菌种为敲除E.coli BL21(DE3)中的pgi和Ugd基因获得的工程菌株E.coli-Delta;pgiDelta;UGD。
  6. 为了使工程菌更好地合成UDPG，还需将重组了pyrF基因的pCDFDuet-1质粒导入。
  7. 蔗糖合酶与UDPG糖基转移酶共表达质粒构建及鉴定
  8. 应用PCR技术扩增所需的AtSUS1基因、GT-19 I194G突变体基因和PyrF基因。质粒pETDuet-1所选定的克隆位点为：前Ncol和HindⅢ 后Ndel和Xhol，使用相应的限制酶将AtSUS1基因克隆至前位点，将GT-19 I194G突变体克隆至后位点，构建出共表达质粒pAT-GT。将PyrF基因克隆至pCDFDuet-1构建出pCD-F质粒。
  9. 取工程菌株E.coli-Delta;pgiDelta;Ugd菌种接入新鲜LB液体培养基中，37℃、220r/min培养至OD600=0.5时，4℃下12000times;g离心，得菌体沉淀，采用CaCl2法制备感受态细胞，并完成pAT-GT质粒和pCD-F质粒的转化。向管中加入少量LB液体培养基，将工程菌培养至正常生长状态。
  10. 将上述菌液接种于含链霉素和氨苄青霉素的LB固体培养基筛选平板上，挑取阳性重组子，接种于100mL新鲜LB液体培养基中诱导蛋白表达，条件选择为已知的诱导GT-19 I194G突变体重组蛋白的最佳条件，20℃、终浓度0.6mM的IPTG和诱导20小时。
  11. 培养完毕后12000times;g离心收取菌体，并用相应的缓冲液洗涤2次。菌体称重，按菌体：缓冲液=1g：10mL的比例重悬菌体至菌体混合均匀。利用超声破碎仪冰浴破碎菌体3min（工作3s，停顿3s），12000times;g离心15min，离心所得上清为粗酶提取液。
  12. 制备SDS-PAGE所需凝胶，取粗酶提取液，加入Loading buffer，煮沸离心后，上样，90V电压跑浓缩胶，120V电压跑分离胶，直至溴酚蓝恰好跑出分离胶。结束后，加入考马斯亮蓝染色液染色3小时，脱色液过夜脱色直至背景清晰。鉴定目的蛋白GT-19 I194G突变体和AtSUS1是否表达，并得到目的蛋白的相对可溶性表达量。
  13. 设计500mu;L的反应体系，含过量的罗汉果苷ⅢE、过量的蔗糖、10mM UDP和工程菌诱导表达后制备的粗酶提取液。条件选择为已知的GT-19 I194G突变体重组蛋白的最佳反应条件，25℃、pH9。反应24小时后，加入等体积甲醇终止反应，12000times;g离心10min，收集上清。上清液用0.22mu;m有机滤器过滤，HPLC分析底物和产物情况，通过反应的转化率评估目的蛋白的活性。
  14. 以相反顺序构建pGT-AT质粒，以相同方法重复以上步骤1）至6），
  15. 蔗糖合酶与UDPG糖基转移酶共表达条件的优化

选择上述两组中目的蛋白表达量及转化率较高的工程菌，进行扩大培养。以此种工程菌，利用单因素分析方法，构建一系列液体培养基来考察诱导表达目的蛋白GT-19 I194G突变体和AtSUS1的最适诱导温度、诱导时间和IPTG浓度。采用与5）和6）相同方法检测蛋白表达量及转化率。

  1. 酶联循环反应条件的优化

以步骤3中获得的最适共表达条件，诱导表达目的蛋白，并获得粗酶提取液，以此粗酶提取液作为反应条件优化所用酶液，利用单因素分析方法，构建一系列催化体系来考察AtSUS1催化蔗糖生成UDPG偶联GT-19 I194G糖基化罗汉果苷ⅢE生成赛门苷I的最适反应pH、温度和蔗糖浓度。采用与6）中HPLC相同的方法检测转化率。

  1. 文献综述

糖基化修饰是一种改善天然产物或药物前体水溶性、稳定性、生物活性物理性质以及生物活性等的重要手段之一。化学法糖基化修饰的选择性极差，而与之相比，酶法糖基化修饰具有反应条件温和、选择性强以及绿色环保等优点，是化合物糖基化修饰的良好方法。其中，UDPG依赖的糖基转移酶(UGTs)在化合物的立体选择性和位置特异性修饰中展现出巨大的潜力，但是，UGTs催化的糖基化反应需要使用大量的UDP-糖基供体，如UDP-葡萄糖(UDPG)、UDP-半乳糖(UDPGal)及UDP-葡萄糖醛酸(UDPGA)等,而这类外源性添加的UDPG糖供体价格高昂，这成为其工业化应用的主要局限。构建一个体外再生循环体系，就能避免UDP-糖基供体在糖基化反应中的使用，有效降低成本促进其工业化发展。

基于蔗糖合酶(SUS; E.C. 2.4.1.13.)的UDP-糖基供体的循环再生是一种实现UDPG的高效循环的理想方案。1955年，Cardini等［1］首次在小麦胚芽中发现了蔗糖合酶。迄今为止，已在包括拟南芥[2]在内的多种高等植物中发现。SUS能够催化蔗糖的合成和裂解，尽管该反应是可逆的，但是在较高浓度的蔗糖存在下，它的生物学功能被认为是合成葡萄糖核苷酸二磷酸衍生物[3]，即催化UDP和蔗糖形成活性糖基供体UDPG和果糖，因而可利用SuS与UGTs构建体外偶联再生体系(图1)。该方法不仅能够减少了UDPG的使用，而且只需一部级联反应就能完成UDPG的循环，还可以避免由于糖基化反应产生出的UDP过量而造成对UGTs的产物抑制效应［4］，糖供体也是非常廉价的蔗糖。

图1 基于蔗糖合酶和糖基转移酶的UDP-糖基供体的循环再生系统

拟南芥的SUS家族包括命名为AtSUS1-AtSUS6的六个不同成员[5]，由于其中的AtSUS1不存在底物抑制[6]而被使用较多。Masada等［7］将来源于拟南芥(Arabidopsis thaliana)的蔗糖合酶AtSUS1与长春花(Arabidopsis thaliana)姜黄素糖基转移酶CaUGT2分别进行体外表达与纯化，采用一锅双酶体系催化姜黄素的糖基化，其产量提高了7倍，添加的UDPG减少至初始水平的十分之一。

罗汉果(Siraitia grosvenorii)中含有的罗汉果苷是一种天然的非糖甜味剂，其甜味取决于葡萄糖糖基化的数量，甜味强度可达蔗糖的250倍[8]，赛门苷Ⅰ(Siamenoside Ⅰ)是目前发现的罗汉果苷中甜味最大的成分，但其在罗汉果中的含量甚少[9]。各种罗汉果苷由原本具有强烈苦味的葫芦素(Mogrol)在C3、C11、C24和C25逐步糖基化而成，其中赛门苷Ⅰ由罗汉果苷ⅢE通过糖基转移酶UGT94-289-2专一性地糖基化得到[10](图2)。

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