开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）
纳米疫苗的构建及初步免疫学评价
摘要：肿瘤免疫治疗近年来成为研究的热点，在临床和实验室中具有良好的疗效和研究前景，以DC为基础的免疫疗法在当今肿瘤治疗中是最有价值也是最有前途的方法之一。本课题拟以树突状细胞（DC）为主要研究对象，以聚乙二醇-聚天冬氨酸嵌段共聚物（PEG-PAsp）为药物载体包裹抗原制备胶束，激活树突状细胞（DC），期望激活免疫系统以达到杀死肿瘤细胞的目的，并完成纳米疫苗的构建和该纳米疫苗的初步免疫学评价。
关键词：DC疫苗，PEG-PAsp，纳米疫苗，肿瘤免疫治疗
肿瘤一直是人类亟待攻克的难题之一，目前治疗肿瘤的方法有手术切除、放疗、化疗、靶向治疗、过继性免疫细胞治疗、肿瘤疫苗等。而随着免疫学、分子细胞生物学、肿瘤药理学等相关学科的快速发展和交叉渗透，肿瘤免疫治疗在实验室研究和临床应用中得到众多研究人员的青睐。与以往的手术、化疗、放疗和靶向治疗不同，肿瘤免疫治疗是一种通过激活人体自身免疫系统来对抗肿瘤的治疗手段，其在多种癌症包括黑素瘤、白血病、前列腺癌、肺癌等治疗中取得了令人欣喜的疗效，并在2013年免疫抗癌疗法被Science杂志评为年度10大科技突破之首。
肿瘤免疫治疗有多种治疗策略，包括非特异性免疫刺激剂、肿瘤疫苗、过继性免疫细胞疗法以及单抗治疗。在众多治疗策略中，肿瘤疫苗目前显示出良好的临床应用前景。肿瘤疫苗是利用含有肿瘤特异性抗原（TSA）或肿瘤相关抗原（TAA）的肿瘤细胞、胞外体（EXO）、多肽及核酸序列等诱发患者自身特异性免疫应答，克服免疫抑制状态，从而抑制肿瘤生长甚至清除肿瘤的主动免疫治疗方法。其优势在于特异性抗肿瘤效应强，安全性相对较高，并能诱导免疫系统的抗肿瘤免疫记忆而发挥持久的抗肿瘤作用。关于肿瘤疫苗的分类，迄今尚无统一的标准，但大体可将肿瘤疫苗分为抗原疫苗、肿瘤细胞疫苗、树突状细胞(DC)疫苗、核酸疫苗、多肽疫苗、抗独特性抗体疫苗等。有研究表明，以DC为基础的免疫疗法在当今肿瘤治疗中是最有价值也是最有前途的方法之一。
树突状细胞(DC)是由美国学者Steinman于1973年发现的，具有体外高迁移性，即突起沿黏附表面伸缩，因其成熟时伸出许多树突样或伪足样突起而得名。DC是目前已知体内抗原递呈能力最强的抗原递呈细胞，其作用主要是作为人体免疫系统的岗哨，不断在其周围环境中寻找抗原。未成熟DC通过受体介导的吞噬作用及巨胞饮作用摄取抗原并在细胞内将其加工，同时自身逐渐成熟。成熟DC高表达MHC（I类、Ⅱ类）分子、协同剌激分子（B7-1、B7-2）、黏附分子（ICAM-1、ICAM-2、LFA-1、LFA-3）、CD40、CD50等，并分泌多种趋化因子和细胞因子，通过抗原提呈，直接激活初始T淋巴细胞。因此上述过程可促进T淋巴细胞的活化，诱导产生大量CD8 的CTL，并启动效应T细胞迁移至肿瘤部位，同时可通过合成和分泌一些细胞因子溶解肿瘤细胞，从而达到清除肿瘤细胞的目的。目前树DC疫苗构建的常用方法有：肿瘤特异性表位肽刺激DC、肿瘤细胞溶解物致敏DC、肿瘤细胞与DC融合、肿瘤细胞来源基因修饰DC、胞外体（EXO）负载DC等。
在临床试验中大多数肿瘤疫苗采用的是多肽抗原，但是临床效果也是有限的，表现为如表位小，免疫原性弱，难以引起高强度的免疫应答；半衰期短，表位选择困难；容易产生免疫耐受；靶细胞表面有多种主要组织相容性复合体(MHC)，需要克服MHC限制性。为解决以上存在的问题，有研究人员尝试使用纳米药物输送系统将肿瘤抗原递送至体内的抗原递呈细胞，不仅可以保护抗原不被机体快速降解和清除、有效延长抗原的作用时间，还可以提高抗原的摄取和递呈效率、增强疫苗的免疫效应。纳米药物输送系统可以发挥纳米佐剂的作用，通过多种途径提高肿瘤疫苗的免疫效应和治疗效果，如能够使肿瘤疫苗靶向于淋巴组织或进一步靶向于树突状细胞，能够促进交叉递呈或调解免疫应答类型(Th1或Th2型)，还可实现肿瘤疫苗和免疫增强剂的共同传递，使两者能够作用于同一抗原递呈细胞，更好地发挥协同作用。纳米药物输送系统在肿瘤多肽疫苗中已有应用，如脂质体、聚合物纳米粒、聚合物胶束、金纳米粒、纳米乳等。而其中嵌段共聚物胶束在作为新型给药系统在肿瘤疫苗的应用中具有极其广阔的前景和独特的优势。
嵌段共聚物是指在单一线性分子中存在两种或者两种以上结构不同的链段，可根据需要合成具有特定化学结构、分子量的共聚物。两亲性嵌段共聚物在选择性溶剂中可自组装成超分子有序聚集体（胶束），通过调控嵌段共聚物的嵌段组成，可实现水-油两亲性，并可在水相中形成稳定的胶束。聚合物胶束的粒径通常不超过100nm，相对狭小的粒径范围不仅使它能够避免被肾脏快速消除和网状内皮系统吞噬，而且增强了其血管通透性，有利于药物在肿瘤部位的蓄积，此外，聚合物胶束还具备改变药物体内分布、肿瘤细胞靶向、克服肿瘤多药耐药性等优点。因此，嵌段共聚物胶束作为新型给药系统可以使得药物具有靶向传递、缓释、疗效增强和毒副作用低等优越性，同时胶束影响药物在体内的分布以及药动学行为，并在负载难溶性药物和基因治疗药物都已获得较好的治疗效果。
在本次课题中，我们拟使用本实验室已有良好合成基础的聚乙二醇-聚天冬氨酸嵌段共聚物（PEG-PAsp）作为输送载体来构建纳米疫苗，通过激活树突状细胞（DC）促进T淋巴细胞的活化，以唤醒先天性免疫和适应性免疫系统共同抑制恶性肿瘤的生长。聚乙二醇-聚天冬氨酸（PEG-PAsp）自组装形成载药体进行药物的输送时，疏水性聚天冬氨酸链段组成共聚物胶束的内核，作为释放药物活性成分的贮库，可结合许多难溶性药物；亲水性聚乙二醇链段组成胶束的外壳，因其具有良好的组织相容性，可保护胶束免受网状内皮系统的捕获，延长药物在血液循环中分布时间。故使用该嵌段共聚物包裹抗原制备胶束，有望提高肿瘤疫苗的免疫效应和治疗效果。
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