噬菌体应用的免疫反应机制研究文献综述

究

1 研究背景:

奶牛乳房炎是严重危害全球奶牛业生产的最重要疾病之一。临床型乳房炎可导致牛奶减产、弃奶和奶牛的过早淘汰。隐性乳房炎因无明显体征、隐蔽性强、发病率高，一定条件下可转变成临床型，危害更加严重。我国奶牛乳房炎发病率高达46.4~85.7%，每头牛损失1200~3600元，给乳品产业带来巨大经济损失。奶牛乳房炎病因较多，包括细菌、病毒、支原体和真菌等，其中，金黄色葡萄球菌是目前影响我国奶牛乳房炎首要致病菌，而且治愈困难。因此，研究金黄色葡萄球菌感染机制，探索新型抗菌技术十分必要。黏附是金黄色葡萄球菌感染乳腺组织并引发奶牛乳房炎的关键步骤，在感染早期，金葡菌依赖黏附素黏附至乳腺上皮细胞，产生极少量的或不产生毒素，逐渐分裂增殖，达到一定数量后开始分泌毒素，引发炎症，造成组织损伤，这是金黄色葡萄球菌多引起顽固性临床型乳房炎的原因。噬菌体因能有效裂解细菌被作为一种新型的抗耐药致病菌的潜在抗菌剂和抗生素替代品，正受到国内外学者广泛关注。

噬菌体作为潜在的新型抗菌剂，可在食品保鲜或动物细菌性疾病控制方面有重要意义。但噬菌体活体作为病毒，在应用时仍会被机体免疫细胞识别，产生免疫应答反应，但噬菌体在奶牛乳腺上皮细胞中所产生的免疫机制尚不清楚，因此，本课题拟采用奶牛乳腺上皮细胞和奶牛免疫细胞（巨噬细胞）研究免疫细胞对噬菌体的反应应答机制。

2.实验操作

2.1噬菌体的纯化

（1）从金黄色葡萄球菌平板上挑取单菌落接到装有5mL LB 的试管中，37℃180转摇床培养一夜。

（2）用取2mL 噬菌体加入到已过夜培养细菌的试管中，摇晃几下，静置10-15min.，倒入800mLTSB中，37℃180转摇床培养一夜。

（3）将培养后的液体分装到离心管中，配平，离心机离心（10000转10min）.

(4) 离心后迅速将上液倒入无菌的锥形瓶中，然后倒入超离心的瓶中，配平，用超速离心机80000转离心4小时。

（5） 离心后迅速弃去上清液，倒置，并在沉淀处用笔标记，瓶干后取1mLSM溶液，反复吹打标记处，然后保存到EP管中，并储存在4度冰箱中。

2.2噬菌体效价测定

取噬菌体原液100uL至900uL SM溶液中，并反复吹打，即将原液稀释到10-1，再从10-1取100uL到900uLSM溶液中，即将原液稀释到10-2，以此类推将原液稀释到10-5,10-6,等。然后从已培养金黄色葡萄球菌过夜的液体培养基中取100uL的菌液到5mL的离心管中，再加100uL的噬菌体稀释液，静置10到15min.，再加4mL0.6的LB，晃动后倒在1.8LB的平板上，放入到培养箱中培养。第二天取出数噬菌斑，计算。

2.3细胞传代培养

1. 取出原代细胞，弃去营养液

2. 用PBS缓冲液润洗3次，再用ET酶润洗一次

3. 加入10滴ET酶，放入温箱中消化

4. 消化好的细胞中加入少量营养液，并用吸管将瓶壁上的细胞冲下

5. 补加营养液至5ml左右

2.4 RNA提取、荧光定量PCR等

3 实验进度:

2015.3.42015.3.22 学习基本实验操作及仪器使用，确定课题，查看相关资料文献。

2015.3.222015.4 准备实验，着手实验。

4 参考文献：

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