生物条形码DNA荧光标记探针的制备研究文献综述

课题来源

自拟课题

课题性质

基础研究

课题名称

生物条形码DNA荧光标记探针的制备研究

毕业设计的内容和意义

本课题拟在文献查阅的基础上，设计科学合理的实验方案，以期制备出粒径大小合适的纳米金粒子以及用于检测毒死蜱的生物条形码DNA荧光标记探针。采用柠檬酸钠还原法（取0．01％氯化金溶液l00mL加热至沸腾，磁力搅拌迅速加入4mL 1％柠檬酸钠水溶液）制备出胶体金，通过紫外扫描初步判定胶体金溶液的分散性和均一性，再通过透射电镜进一步确定分散性和均一性，选出合适的胶体金。找出利用胶体金合成探针的最佳方法，并利用紫外分光光度计，透射电子显微镜，zeta电位，动态光散射对所合成的探针进行表征。毒死蜱被广泛应用于农业及卫生害虫防治当中，但它同时也会对农田环境及其有益生物产生一定的影响。本课题将利用不同的方法合成毒死蜱特异性抗体和荧光DNA标记的胶体金探针并通过不同手段对其进行表征，以期找出探针合成的最佳方法。

文献综述

文献综述：

纳米材料于20世纪80年代兴起，是一种纳米级别的材料，其介于宏观物质和微观原子、分子的过渡区域，是一种非常典型的介观系统。纳米粒子具有许多特殊的催化以及光电学性能，因此其应用范围也较广。纳米金就是纳米材料的一个典型代表。胶体金溶液是指分散相粒子直径在l~150 nm 之间的纳米金粒子悬浮液，属于多相不均匀体系，颜色呈桔红色到紫红色。

上世纪七十年代，纳米金颗粒开始作为一种标记物应用于生化分析领域。Faulk等人最先将纳米金颗粒引入到兔抗沙门氏菌当中，已达到提高灵敏度的要求。以纳米金作为标记物具有许多突出的优势：首先，纳米金的制备技术较为成熟，本课题拟采用柠檬酸钠还原法进行胶体金的制备，通过调整还原剂的使用量可以制备出不同粒径大小的胶体金溶液。其次，纳米金的标记过程基本上是大分子物质的物理吸附过程，物质处于纳米级状态时会显现出一些独特的性质，胶体金溶液就是以金核为中心通过静电作用形成相对稳定的多相不均匀体系，具有特有的颜色。胶体金可以与蛋白质通过电荷相互作用牢固结合，又对其活性没有影响，这一优势使得胶体金受到了广泛的关注。且胶体金可以与巯基形成较强的共价键。再向溶液中加入一定量的稳定剂，可以使探针均匀分散在溶液当中，可避免发生聚沉现象。且用纳米金标记后基本不影响各种生物分子的活性，且因其性质较为稳定，可以长期保存。用纳米金标记得到的探针因其易标记，化学性质稳定，灵敏度高，免疫反应过程中不依赖酶反应等特点，使其在生化分析，免疫分析等领域都得到了广泛的应用。

DNA 条形码技术是通过对一段标准化基因DNA 序列的分析来实现对生物物种准确、快速鉴定的技术，为分子诊断领域提供了一个全新的检测平台，也因此成为了近年来的研究热点。Tautz 等人于2002 年首先提出了DNA 分类的概念，即以DNA 序列为基础建立物种鉴定体系。2003 年，美国科学家Mirkin 等人首次报道了生物条形码检测技术（Bio-barcodes assay，BCA）并发表在SCIENCE杂志上，并首先应用于蛋白质分子的检测。生物条形码技术灵敏度很高，可用于诊断医学，生物武器的鉴定，药物与基础生命科学研究。根据所使用的纳米金的颗粒大小的不同，该技术可以将靶分子的信号放大100~300 倍。生物条形码检测技术具有很多优点，除了具有高灵敏度外，还具有不依赖于酶反应的特点。它的检测过程主要通过特异性的抗原抗体反应来实现对靶分子的识别，并通过分离洗涤，对目标分子进行富集，以达到检测的目的。BCA 技术一般使用的是纳米金标记的核酸，这种核酸的特异性一般要高于普通未标记纳米金的核酸。

余宇燕等人利用金纳米颗粒、黄曲霉毒素B1(AFB1)多抗和互补纳米金探针链、条形码DNA 链制备纳米金探针（NP），该探针可用于花生、腰果等坚果类食品中AFB1 的痕量检测。张春燕利用纳米金颗粒，BPA抗体，条形码DNA制得纳米金探针，该探针可用于检测双酚A。

因此，制备出特异性高，稳定性强，灵敏度高的纳米金探针尤为重要。

毒死蜱（chlorpyrifos）是一种高效、广谱、中等毒性的有机磷类杀虫剂，被广泛应用于农业及卫生害虫防治当中，但它同时也会对农田环境及其有益生物产生一定的影响。根据国家环境保护总局公布了的常用农药对水生生物，及陆生生物的毒性，可知农药毒死蜱对鱼类等水生生物高毒，对鸟类、蜜蜂、家蚕等陆生生物易造成危害。迄今为止，很多文献对毒死蜱原药及乳油对环境生物的毒性及安全性研究进行了报道。邓惜汝等人通过藻类生长抑制试验测定了毒死蜱对藻类的毒性效应，结果表明，毒死蜱对实验所采用的3 种藻的生长存在不同程度的抑制效应，发现质量浓度越高，其抑制效应也就越强。王少云对毒死蜱在土壤中的残留和遗传毒性进行了研究，并研究发现毒死蜱农药在土壤中具有积累趋势且具有遗传毒性。本课题将利用不同的方法合成毒死蜱特异性抗体和荧光DNA标记的胶体金探针并通过不同手段对其进行表征，以期找出探针合成的最佳方法。

参考文献：

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研究内容

1. 合成胶体金
2. DNA荧光标记探针的制备：
3. 不同老化时间对探针制备的影响
4. 不同稳定剂对探针制备的影响
5. 探针的表征：

利用紫外分光光度计，透射电子显微镜，zeta电位，动态光散射对所合成的探针进行表征。

研究计划

2017.2.27—2016.3.5 实验准备阶段：确定课题，查找相关文献资料，设计实验过程并购买所需材料与实验器材。

2017.3.5—2017.3.20 合成胶体金并筛选出粒径大小合适的胶体金

2017.3.20—2017.4.10 完成不同老化时间对探针制备影响实验。

2017.4.10—2017.4.30 完成不同稳定剂对探针制备影响实验。

2017.5.1—2017.5.26 整理实验数据, 撰写毕业论文，准备毕业答辩。

特色与创新

1.通常生物条形码是用来测核酸，蛋白质等大分子物质的。本课题是要制备出能测小分子物质的生物条形码。

2.本课题探究了影响探针合成的不同因素。