开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）
1 本课题研究的国内外现状:
群体感应( quorum sensing，QS)是指微生物某些基因的表达受到与细胞密度相关的信号分子调控的现象，即微生物通过合成、分泌自诱导分子(autoinducer，AI)作为信号分子，并检测其浓度，当AI浓度随着微生物群体密度达到一定阈值时，启动特定基因的表达，调控相关的生物学功能，如:菌体发光、抗生素的合成、毒力因子的产生、多糖的合成、细菌丛集、生物膜形成、质粒接合转移、感受态的形成、稳定期的到来等。胞外N-酰基-高丝氨酸内酯类（AHLs)化合物是革兰氏阴性菌群体感应系统中最典型的一类信号分子[1]。细菌细胞通过产生AHL进行信息交流,在微生物世界里调控某些特定生理性状的表达,日益受到人们的关注。
由于信号分子控制细菌许多病基因的表达，因此任何能够阻止QS信号分子集聚或受体识别信号分子的过程都可以阻断依赖细菌QS的毒力基因表达。目前已发现通过许多途径可以干扰细菌的QS系统。大致有以下三种：
- 产生病原菌信号分子的类似物与信号分子受体蛋白竞争结合，从而阻断病原菌的QS系统；
- 利用QS系统中的信号分子来诱发抗性，这在植物中比较常见；
- 产生可以使AHL分子灭活的AHL降解酶，使病原菌QS系统不能启动它所调控的基因。研究表明，不同生物体中都存在类别不同的能够降解AHL的群体感应淬灭酶（Quorum-Quenching Enzyme）[2]。
通过可以编码内酯酯酶从而降解AHL的携带有aiia基因的质粒pME6863转移到荧光假单胞菌P3中，从而使其具有降解AHL的能力。研究表明，假单胞菌P3/pME6863可以产生胞内的aiia内酯酶，从而降解AHL，从而抑制群体感应，抑制食物腐败变质。为防止食品腐败变质提供了一个新的方向[3]。
假单胞菌是导致高蛋白食品腐败的重要细菌。该菌能够在冷藏条件下大量生长,通过产生胞外蛋白水解酶,脂肪水解酶导致传统的消毒奶、鱼肉、蔬菜、水果等的腐败,另外,假单胞菌还大量存在于在食品加工的环境如案板、供水管道系统、地面等,并在此环境中形成生物膜,普通的杀菌消毒措施不能杀死生物膜细菌,导致产品的后污染,使食品储藏后腐败[4]。
- 拟研究或解决的问题：
- 研究aiia蛋白酶对群体感应的抑制作用；②aiia蛋白酶对假单胞菌生物膜形成和蛋白水解酶活性的影响；③aiia蛋白酶对鱼肉腐败作用的影响。
3 研究手段：
3.1 假单胞菌P3/pME6863粗酶液的提取与纯化
（1）将活化的P3/pME6863按1%的量接种于200ml的LB液体基中，28℃摇床培养24h。将发酵液4℃,4000rpm离心20分钟，弃去上清液，沉淀用20mlTris-HCl缓冲液洗一遍，离心，收集菌体。将收集的菌体用20mLTris-HCl重新悬浮，4℃超声破碎（超声条件：功率400W，
3s，间隔3s，重复99次）。然后4℃12000rpm离心20min，收集上清，即为粗酶提取液，4℃保存备用。
