红叶石楠绿色素提取物的初步分离纯化与分析鉴定文献综述

课题名称

红叶石楠绿色素提取物的初步分离纯化与分析鉴定

毕业设计的内容和意义

红叶石楠是一种具有观赏性的蔷薇科植物，通过提取并纯化其叶片中的绿色素，来评价其是否可以作为一种天然资源来补充生产或生活中所需的绿色素。通过测定绿色素的体外抗氧化活性，判断其是否可以用于工业生产，比如，护肤品。因为叶绿素的分子与人体的血红蛋白分子在结构上非常相似，其具有造血功能，对失血患者有很大的帮助。因此，研究此课题是非常有意义的。

本课题主要分离纯化红叶石楠中的绿色素，并分析鉴定红叶石楠中绿色素的主要成分，并研究其体外抗氧化活性。研究其绿色素的一些性质，确定是否有利用价值，为以后的研究做准备。

文献综述

通过查文献得知，提取绿色素的方法有超声波辅助提取、有机溶剂浸提法、丙酮研磨法等，常用有机溶剂浸提法。抗氧化体外评价的方法有：抗油脂过氧化能力测定，清除DPPH能力的测定，还原能力的测定，抑制LOX酶实验。

本次实验通过有机溶剂浸提法，提取红叶石楠中的绿色素，然后离心，通过柱层析的方法将绿色素与其他色素分离开，得到纯化后的绿色素条带。用紫外—可见分光光度仪在一定的波长范围内扫描纯化后绿色素的色谱图，与标准品对比，定性分析绿色素的主要成分，并且通过测定提纯物清除DPPH的能力来考察提纯物的体外抗氧化活性。

郭文莉^[1]的研究通过纸层析、柱层析、化学方法与阳离子交换树脂结合3种方法对其提取液进行了分离纯化研究。结果表明：硅胶柱层析的分离、纯化效果最好。利用紫外分光光度法对纯化后的提取液进行检测，得到的谱带相吻合，且发现纯化后的杂质明显减少。谢宇奇^[2]的研究结果表明：芒果叶绿素优化的提取工艺为：以95%乙醇为提取剂，料液比为1:8（g/mL）；超声的温度、功率和时间分别为60℃、160W和30min。在最佳实验条件下，提取效率比常规浸渍提取法高23.6%左右。陈聪、乔旭光^[3]的研究结果表明：经过实验筛选，先将大蒜绿色素粗提液通过 XAD-16 型大孔树脂吸附，用含 0.2％HCI 的甲醇作为洗脱液，收集绿色素溶液再经过 Sephadex LH-20凝胶树脂，用纯甲醇作为洗脱液，流速为1.2BV/h，即可以达到较好的纯化效果。

拟开展的研究问题：

1. 鉴定红叶石楠中绿色素的主要成分；
2. 初步研究红叶石楠中绿色素的体外抗氧化活性。

[1] 郭文莉.葡萄皮色素提取、纯化与抗氧化活性的研究[D].新疆农业大学,2007,6.

[2] 谢宇奇.芒果叶中提取工艺、性质及芒果苷含量测定的研究[D].广西大学,2013,11.

[3] 陈聪,乔旭光.大蒜绿变色素分离纯化的研究*[J].中国食物与营养,2008(7):38-41.

[4] 张丽华,顺峰,兴华等.猕猴桃果肉叶绿素的提取及抗氧化活性研究[J].中国食品学报,2012,12(7).

[5] 何启平,陈莹.校园常见植物叶绿素提取方法比较及其含量测定[A].黑龙江农业科学,2015(10):117~120.

[6] 龚金华,张玥,张智超等.现代分离纯化技术在天然植物色素中的应用[J].中国食物与营养,2014,20(12): 54-57.

[7] 陈鹏飞.大白菜类胡萝卜素分离鉴定和积累机理与调控研究[D].扬州大学,2008,6.

[8] 李晓银.柿子皮中类胡萝卜素化合物的分离鉴定及稳定性研究[D].西北工业大学,2006,3.

[9] 韩占江,伟华.层析法在分离纯化番茄红素中的应用[B].湖北农业科学,2008,47(6):701-703.

[10] 郭涛.枸杞类胡萝卜素的分离纯化方法[A].中国果菜,2014,Vol.34,No.04.

[11] 孔祥海,李思,丁力等.红叶石楠叶片发育的形态特征及色素含量变化[A]. 北方园艺,2015(24):51~55.

[12] 侯冬岩,回瑞华,刘晓媛等.黑茶茶绿色素的分析[A].鞍山师范学院学报,2009-12,11(6):26-28.

[13] 马骏,王超,李秀妹等.绿色植物色素的提取和色谱分离[J].化工时刊,2009,23(10):46-49.

研究内容

1. 提取红叶石楠中的绿色素，得到提取液；
2. 分离纯化红叶石楠中的绿色素，得到纯的绿色素；
3. 分析分离纯化后的绿色素，定性鉴定绿色素的主要成分；
4. 初步考察红叶石楠中绿色素的体外抗氧化活性。

1、红叶石楠绿色素的提取

1.1 红叶石楠叶片制粉

在中国药科大学校园中摘取生长旺盛，叶龄相近的叶子；洗净；在鼓风干燥箱烘24h；去叶脉；称重至恒重；真空干燥箱45℃干燥1h；用粉碎机粉碎，1min3次，过筛，使用100目的红叶石楠粉。

1.2红叶石楠绿色素的提取

称取红叶石楠粉1.5g，按照料液比1:8，准确称取乙醇12mL，放在50℃恒温水浴箱中浸提2h，离心（3000转/s，离心2分钟），取上清液备用。

2 、红叶石楠绿色素提取物的分离纯化

2.1制作层析柱

取一支干净的色谱柱，关闭活塞；称取20.0g硅胶，溶于60-80mL的石油醚/丙酮（4:1）的溶液中 ，用玻璃棒边搅拌边倒入层析柱中，静置10分钟。

2.2柱层析

打开活塞，使溶剂流至吸附剂上方1-2mm，剪一片大小合适的滤纸片，放在吸附剂上方。加入1-2mL的离心后的提取液，加完后，打开活塞，液面下降至柱面上方1-2mm左右，向层析柱中添加洗脱剂（石油醚：丙酮 = 4：1）。色素即将全部进入层析柱时，继续添加洗脱剂。色素进入柱中会形成不同颜色的条带，当绿色条带被洗脱下来时，用一次性小试管接收，备用。在整个过程中，要始终保持洗脱剂高于柱的表面（防止空气进入层析柱，形成气泡，影响分离效果）。

3.分析鉴定

用洗脱剂（石油醚：丙酮 = 4:1）作为对照，在663nm、645nm测定吸光度。运用紫外—可见分光光度计在420nm-670nm、-670nm测定纯化后绿色素的光谱图，以及标准品的光谱图，对比。定性分析提取物中的主要成分。

4.体外抗氧化活性

DPPH是一种稳定存在的有机自由基，由于苯环的内轭和位阻及小鸡的吸电子作用，呈现紫色，被还原后变为浅黄色，通过测定反应体系在525nm附近的吸收峰的下降程度可直接评价材料抗氧化活性的强弱。

将红叶石楠纯化后的绿色素配制成体积分数为0.01%的水溶液，DPPH·溶液配成2times;10^-1mol/L无水乙醇溶液。以无水乙醇作为对照，对DPPH溶液进行440~660nm可见光区扫描。

精确吸取纯化后的红叶石楠绿色素3mL，与制备好的DPPH溶液混合，摇匀，静置30min。相对应的溶剂（3mL石油醚：丙酮=4:1溶液与3mL无水乙醇混合溶液）作为对照，用分光光度计测定上述混合溶液在517nm除的吸光值，测定3次，取平均值（A_i）。

精确吸取纯化后的红叶石楠绿色素3mL，与3mL蒸馏水均匀后，以石油醚：丙酮=4:1溶液作为对照，在517nm除测定吸光值，测定3次，取平均值（A_j）。

精确吸取2times;10^-1mol/L的DPPHbull;溶液3mL与蒸馏水混匀后，以3mL蒸馏水和3mL无水乙醇的混合溶剂作为对照。在517nm测定吸光度值，测定3次，取平均值（A₀）将上述数据代入公式计算清除率。

清除率SR（%）={1-[(A_i-A_j)/A₀] }times;100%

实验流程：红叶石楠叶片—洗净—烘干—去叶脉—真空干燥—粉碎—过筛—称重—有机溶剂浸提—离心—柱层析—紫外/抗氧化活性

研究计划

2017.2.26-2017.3.12 确定选题，查找资料，确定实验方案，准备实验所需的仪器和试剂；

2017.3.13-2017.4.2实验前期：研究如何能将红叶石楠中的绿色素最大化的分离出来，并且调整实验方案；

2017.4.3-2017.4.30实验后期：定性确定红叶石楠绿色素的主要成分，并初步确定其体外抗氧化活性；

2017.5.12017.5.28 整理实验数据，撰写毕业论文，准备答辩。

特色与创新

此课题，首先，选材独特，在查阅资料的过程中，发现很少有人将红叶石楠作为研究对象，作为观赏型的植物，很少有人会发现它的价值；其次，确定其红叶石楠绿色素的成分，可以为以后的研究提供理论依据，红叶石楠绿色素的主要成分是叶绿素，叶绿素可以排毒养颜，天然植物中的叶绿素可作为可再生资源来发展生产；最后，研究其抗氧化活性，来判断其抗氧化能力的强弱，评价提取物是否可作为抗氧化剂来做研究，以及开发红叶石楠的使用价值，将易得的材料作为资源来创造它的价值。