RIPK1抑制剂设计与合成开题报告
摘要： 坏死性凋亡是新发现的一种细胞死亡方式，不同于正常的细胞凋亡，坏死性凋亡的通路不依赖Caepase8且不形成坏死小体。TNF-alpha;通路是目前研究最多的介导坏死性凋亡的通路机制，RIPK1是该通路的一个关键性因子，该激酶由N-端激酶结构域、RIP同型相互作用模块 (RHIM)和C-端死亡结构域组成，在之间有一个变构性调节激酶活性的疏水性结合口袋，RIPK1抑制剂均作用于此。目前研究发现，坏死性凋亡与感染性疾病、神经系统疾病、炎症的发生密切相关，因此，RIPK1抑制剂具有重要的药物开发价值。本课题通过对RIPK1结构的研究，筛选具有潜在应用价值的化合物并设计优化一系列合成途径，最终进行活性测试。
课题背景：程序性细胞死亡对于维持机体的正常发育和保证组织器官的功能正常有着极其重要的作用，此过程通常以细胞凋亡的方式表现出来。而在2005年，Degterev 等人发现了一种可被Necrostain-1(Nec-1)抑制的新型细胞死亡方式——坏死性凋亡（Necroptosis）[1]。不同于细胞凋亡过程中的形成凋亡小体和细胞膜的相对完整，坏死性凋亡的是形态学特点是细胞膜通透性发生改变，细胞肿胀，最终细胞破裂，内容物释放，引起免疫反应，其表现形式和细胞坏死非常接近。一直以来人们都认为细胞的坏死是由于物理或者化学条件的改变而导致的被动死亡，坏死性凋亡的发现打破了这一认知。受体相互作用丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶 1(RIPK1)、受体相互作用丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶3(RIPK3)和混合系蛋白激酶样结构域蛋白（MLKL）是参与坏死性凋亡过程的关键分子。目前对于坏死性凋亡的分子机制有多个通路模型如Toll样受体模型等，主要认识来源于肿瘤坏死因子（TNF-alpha;）诱导的坏死性凋亡信号通路的研究。
针对TNF-alpha;的研究目前已经较为成熟，其不仅广泛地参与炎症反应，在一定条件下也能对细胞的程序性死亡起到重要的调控作用。当TNF-alpha;与细胞膜上的 TNF受体1（TNFR1）结合后，含有特殊保守结构域的TNFR1构象发生转变，并通过该结构招募TNFR1相关死亡结构域蛋白（TRADD），后与RIPK1初步形成复合体，两者在此相当于支架蛋白，后继续招募TNF受体2（TNFR2）和细胞凋亡抑制蛋白1和2(c-IAP1/2), 最终共同组成复合体1。该复合体激活能够促进细胞存活的核酸转录因子（NF-kappa;B）通路。有意思的是，通路的激活和复合体1各个组分的泛素化有关，尤其与RIPK1的多聚泛素化有着密切的关系。
RIPK1的泛素化主要由c-API1/2和线性泛素化链组合体（LUBAC）所介导[2]。c-API1/2具有E3泛素连接酶的活性，能够对RIPK1进行多聚泛素化修饰，使其作为支架蛋白招募转化生长因子活化激酶 1 (TAK1)和 TAK1 结合蛋白，进而激活NF-kappa;B通路。而存在着多种酶可以调节RIPK1泛素化的水平，如线粒体促凋亡蛋白（SMAC）可抑制c-API1/2，阻断其对于RIPK1的泛素化，若RIPK1未泛素化或是去泛素化，将导致复合体Ⅱa的形成，使其不能表达用于抑制半胱氨酸酶8（Caspase8）的胞内FLICE抑制蛋白（cFLIP），细胞执行经典凋亡过程。若RIPK1泛素化过程受到抑制，c-API1/2失去活性，RIPK1则会募集同源激酶RIPK3、FADD和FLIPL组成复合体Ⅱb，最终激活Caspase8导致细胞凋亡，与复合体Ⅱa诱导的方式大致相同[3]。
需要注意的是，复合体Ⅱb通常情况下仍然执行经典凋亡过程，只有当Caspase8失去活性或者缺失后才能诱导坏死性凋亡，例如被病毒反转蛋白或被合成的caspase抑制剂QVD-OPH抑制,此时Caspase8无法抑制RIPK1和RIPK3的活性，使其诱导细胞坏死性凋亡[4]，具体过程为RIPK1与RIPK3通过RHIM结构域发生相互作用，在细胞质中形成淀粉蛋白斑块，即坏死复合体（necrosome）[5]。在坏死复合体中,RIPK1磷酸化激活RIPK3,后者将招募MLKL并将其苏氨酸357位点和丝氨酸358位点磷酸化，这会导致其构象转变并导致其四螺旋束结构域的暴露[6]，关于MLKL促使细胞凋亡的机制有所争议，一般来说分为两种，一说是MLKL齐聚化后并定位于细胞膜，通过控制阳离子通道改变细胞膜通透性。二说是MLKL将在细胞膜上形成孔状结构直接破坏细胞质膜，最终细胞质中的损伤相关的分子模式(DAMPs)通过破裂的质膜释放出来，导致炎症和器官损伤。
由此可知RIPK1在诱导细胞坏死性凋亡时发挥着重要的作用，由于坏死性凋亡会导致细胞内容物释放到细胞之间，会引起炎症等相关反应，因此研究针对RIPK1的抑制剂的重要性不言而喻。临床试验也证实编码RIPK1的基因和多种调节RIPK1信号传导的蛋白质突变可导致免疫性和自身炎症性疾病，据报道患有炎症性肠病的儿科患者在炎性组织中 RIPK3 和 MLKL 水平升高，而 Caspase-8水平降低[7]。除了炎症反应，根据实验，RIPK1的抑制剂Nec-1能有效降低肿瘤，心肌梗死，中枢神经系统退行性病变，动脉粥样硬化，缺血-再灌注损伤等疾病中由于细胞程序性死亡而导致的死亡[8]。
RIPK家族包含7个成员，为双特异性激酶，包含N-端激酶结构域和RIP同型相互作用模块 (RHIM)，靶向底物中的酪氨酸和丝氨酸/苏氨酸残基，这些RIPKs是细胞生存、细胞死亡编程和死亡结构域受体信号转导后的炎症信号转导、细胞应激和感染的关键介质。RIPK1是一个76 kDa的蛋白质，也是RIPK家族中唯一具有C末端死亡结构域（DD）的成员，通过DD被招募到不同的信号复合物中，从而启动不同的通路。RIPK1激酶结构域与其配体Nec-1a结合的晶体结构 (PDB: 4ITH)显示该蛋白具有典型的激酶结构，包含N-lobe, C-lobe和介于中间的活性环区 (activation loop)。截至目前，已报道的RIPK1抑制剂均作用于这一环形口袋，蛋白激酶可以采用两种由激活环协调的构象:活性的DFG-in构象和非活性的DFG-out构象(RIPK1的dfg -motif)。RIPK1/3激酶抑制剂具有I型、II型或III型激酶结合模式。I型激酶抑制剂占据ATP结合位点(N-lobe和C-lobe之间的催化位点)，并靶向激酶的活性DFG-in构象。II型激酶抑制剂通过与铰链区、DFG基序中的带负电荷的天冬氨酸残基和变构疏水后囊相互作用，靶向ATP结合囊袋，结合蛋白激酶的非活性DFG-out状态[9],III型别构激酶抑制剂也有针对性。RIPK1晶体结构的获得为基于结构的药物设计提供了结构基础。以Nec-1s为代表的色氨酸系列是RIPK1小分子抑制剂的重要里程碑，葛兰素史克公司报道了一系列苯并杂卓类化合物，部分化合物已经进入I期临床实验。借助于靶点结构的特性以及已经总结出的RIPK1抑制剂的种类，计划利用数据库进行虚拟筛选得到先导化合物，设计不同系列化合物探索最佳母核，同时运用基于片段的药物设计手段，结合类药性早期预测，定点引入合理的修饰基团，合理设计目标化合物。
设计思路：通过对文献RIPK1抑制剂GSK2982772的共晶结合模式分析，结合CADD的应用设计先导化合物R1。通过对阳性化合物的共晶结构研究发现：GSKrsquo;772以III型抑制剂的方式与RIPK1蛋白发生相互作用，苯并氮杂卓占据ATP口袋却不与铰链区氨基酸发生相互作用；连接在三氮唑上的Linker酰胺羰基与Asp156的主链酰胺NH通过氢键相互作用。三氮唑的N原子与Met67和Val76的羰基氧形成水介导的氢键。为了进一步探索RIPK1抑制剂结合模式和构效关系，设计的先导化合物R1具有与GSKrsquo;772相似的苯并氮杂卓骨架。利用拼合原理，在保留GSKrsquo;772的骨架和linker结构的同时，将三氮唑基团替换为前期化合物数据库筛选的具有良好RIPK1的激酶活性的化合物的异丙苯片段。Maestro对接显示，R1与GSKrsquo;772采用相同的III型抑制剂结合方式，保留铰链区氢键，且异丙苯片段疏水区的Phe162形成pi;-pi;相互作用，可能进一步加强小分子抑制剂与RIPK1蛋白的结合。在R1基础上又设计改变linker区结构的化合物，将酰胺基团改为脲的结构，一方面期望改善化合物的透膜性，另一方面探索针对改变Linker区的结构改造是否可行。
研究方式：本课题计划在化合物R1的基础上进行修饰，合成2个相关化合物。约经过6-7步化学反应，涉及到亲核反应、缩合反应、Buchwald偶联反应等。终产物经氢谱、质谱、碳谱、HPLC等手段进行结构确证，并进行体外酶活测试。
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