一、文献综述
世界卫生组织(World Health Organization, WHO)报告显示，2018年全球新增癌症确诊病例约1810万例，死亡病例约960万例[1]。据统计，肺癌(11.6%)、乳腺癌(11.6%)、前列腺癌(7.1%)确诊率在全球范围内位居榜首，肝癌、胰腺癌发病率也较高，可见实体瘤的患病率和死亡率处于较高水平。值得关注的是，亚洲占全球癌症发病率约50%，其中中国新增病例380.4万例，死亡病例229.2万例，同时位居癌症发病人数、死亡人数全球两大榜首，这足以说明癌症仍然是困扰中国人健康的一大难题。
2015年中国恶性肿瘤报告指出，与全球癌症发病率不同的是，在中国，肺癌、胃癌、结直肠癌及肝癌较为常见[2]。其中肝癌是引发死亡的三大癌症之一，因其预后非常差，且5年总生存率(OS)仅12%，给临床治疗带来了很大困难。肝癌的发生与肝损伤，炎症和再生有关，大多数肝癌(80-90%)是由潜在的慢性肝病发展而来的，主要病因包括慢性乙型肝炎病毒(HBV)或丙型肝炎病毒(HCV)感染、饮酒、非酒精性脂肪性肝炎或其他不常见的病因，如血色素沉着症、烟草和黄曲霉毒素B1[3-6]以及肠道微生物异变[7]等。肝癌发病率最高的地区是东南亚和中非，那里的慢性HBV感染流行率占比约70%[6]。肝癌在早期被诊断时，可采用局部手术治疗，包括手术切除，射频消融，经动脉化疗栓塞或肝移植[8]。但遗憾的是，大部分肝癌患者都是在无法采用手术切除肿瘤的晚期时被诊断出来，在这样的情况下，分子水平的靶向治疗成为了较理想的选择。
索拉菲尼在2007年被FDA批准用于治疗未能进行手术的肝细胞癌（HCC），可显著改善晚期肝细胞癌患者的无进展生存期和总生存期[9]，是一种有效的多激酶抑制剂，包括血管内皮生长因子受体，血小板衍生的生长因子受体和RAF原癌基因丝氨酸/苏氨酸蛋白家族激酶等[10]。索拉菲尼通过抑制Raf，Raf-1和B-Raf的丝氨酸/苏氨酸激酶同工型来阻断癌细胞的增殖。具体而言，它抑制了促分裂原活化的蛋白激酶/细胞外信号调节激酶（ERK）信号通路，并降低了细胞周期蛋白D1的表达，使细胞周期停滞[11]。索拉菲尼对血管内皮生长因子受体（VEGFR）2，VEGFR 3，血小板源性生长因子受体-beta;（PDGFR-beta;），Flt3和c-Kit等制酪氨酸激酶受体的抑制作用，能有效抑制血管新生。这种抑制作用阻断了多个过程，包括增殖、血管生成和凋亡，从而导致肿瘤血管面积减少和癌细胞饥饿的发生。此外，索拉菲尼通过抑制肝癌细胞中含有SH2结构域的酪氨酸磷酸酶(SHP-1)的信号转导和转录激活因子3型(STAT3)磷酸化(Tyr705STAT3)以及相关蛋白Mcl-1(髓细胞白血病1)、survivin和cyclin D1，从而增强TRAIL诱导的细胞死亡过程[12]。
由于肝肿瘤内的淋巴管和血管异常，以及渗透保留效应(EPR)的增强，导致肝肿瘤周围的组织液压升高[13]，在某些特定的情况下，如肿瘤的典型特征炎症、缺氧、梗死等身体病理部位的血管壁内皮内膜的通透性比正常情况下更高，因此，大分子或一些纳米级的颗粒会离开血管床，在缝隙中聚集的现象属于被动靶向运输。如果将抗癌药物装载在大(聚合)分子/粒子中，并使其易于释放，就利于其进入肿瘤细胞。这种自发聚集或被动靶向，导致肿瘤缺乏淋巴引流的现象被称为渗透保留效应(EPR) [14] 。传统化疗依赖于低分子量药物，其生物分布差，药代动力学差，造成严重的副作用。当抗癌药物的大小增加到纳米级时，它超过了40000Da的肾脏清除阈值，可以减少肾脏排泄，延长血液半衰期，提高在靶点的积累量。纳米药物通过EPR作用，延长循环时间，更易在肿瘤内积聚[15]。虽然索拉菲尼具有较高的胃肠道（GI）渗透性，并具有较长的生物半衰期（25-48小时），但因其水溶性很差，导致口服生物利用度较低[16]。利用纳米制剂来有效提高索拉菲尼的口服生物利用度是一种可行的方法。Sang等人使用脂肪和超临界流体（NUFStrade;）进行索拉菲尼纳米颗粒化，显著提高了索拉非尼的吸收，同时阐述了纳米配方的选择对最终药物的吸收情况有很大的影响[17]。PLGA是一种功能高分子有机化合物，由乳酸(lactic acid,LA)与羟基乙酸(glycolic acid,GA)共聚合而成。当PLGA进入体内,通过酯键水解生成相应的单体酸、乳酸和羟基乙酸,这些降解产物同时也是人体正常代谢途径的产物，因此该聚合物对人体无刺激性,无毒且拥有良好的生物相容性和降解性[18]。Zachary等人利用PLGA制备了一种不含稳定剂且无毒的能有效包裹质粒DNA的纳米颗粒制剂，并证明了其具有出色稳定性和生物相容性。通过改变PLGA的化学计量实现了对纳米颗粒粒径大小的把控，并通过弹性蛋白样聚合物对其进行了修饰，以提高免疫耐受性[19]。Shadi等人在体外探究了一种包含二甲双胍（MET）的纳米纤维（NFs）对肺癌术后治疗的功效，数据显示该纳米纤维比游离的MET显示出更好的细胞毒性和诱导癌细胞凋亡的能力，并说明此纳米纤维有着作为可植入的药物输送系统，用于抑制手术切除后的肺癌复发的潜力[20]。还有研究者发明了一种载有二硫仑的PLGA纳米颗粒，在将其用于治疗非小细胞肺癌的过程中，该纳米颗粒增加了双硫仑（DSF）释放速率和细胞毒性，展现出显著的抗癌活性[21]。这些研究结果都显示出以PLGA为材料制作纳米递送系统在肿瘤治疗方面的良好前景。
众所周知，肿瘤可以抑制免疫反应，负调控通路或检查点在肿瘤逃避免疫系统检测中发挥关键作用[22]，而程序性细胞死亡蛋白1（PD-1）就是其中一个检查点，PD-1是由人的Pdcd1基因编码的具有288个氨基酸（aa）的Ⅰ型跨膜蛋白。当与靶细胞PD-L1和PD-L2的配体结合时，发挥其作用[23-24]。PD-L1是具有290aa的Ⅰ型跨膜蛋白，由人的Cd274基因编码，其中PD-1只能在T细胞上表达，尤其是在活化的T细胞上，但不在静止的T细胞上表达，而PD-L1可以在许多其他细胞类型上表达，包括免疫细胞，上皮细胞，内皮细胞，间充质干细胞，骨髓源性肥大细胞和肿瘤细胞[25-26]。PD-L1结合T细胞表面上的PD-1受体，然后与T细胞受体（TCR）聚集在一起，并通过PD-1的两个含酪氨酸的基序募集SHP2 （含Src同源2域的酪氨酸磷酸酶2）（ ITIM和ITSM），从而通过TCR和共同刺激CD28抑制T细胞活化，可调节下游途径，包括PI3K / AKT，RAS / Raf和磷脂酶Cgamma;（PLCgamma;）。SHP2可以通过降低细胞因子的表达来抑制T细胞的活化，增殖，存活以及T细胞依赖性免疫反应[27-29]。PD-1 / PD-L1途径可通过这种机制抑制病原性自身反应性效应T细胞，从而避免免疫失控并预防有害的宿主病变[30]。研究发现，宿主免疫细胞上PD-L1的表达可以促进肿瘤免疫逃逸，在肉瘤细胞中分别敲除和过表达PD-L1，证实了肿瘤细胞中的PD-L1是促进肿瘤免疫逃逸的关键，再用IFN-gamma;阻断抗体治疗小鼠，在很大程度上消除了肿瘤细胞上的PD-L1表达，但仅部分降低了肿瘤相关巨噬细胞上的PD-L1水平，表明宿主细胞上PD-L1的表达对肿瘤免疫逃逸也很重要[31]。PD-L1在肿瘤细胞中的表达是由内外因素共同作用的。PD-L1的表达又可分为诱导性表达、微环境中的外源性因素表达和组成性表达、内源性肿瘤驱动基因改变表达。外源性因素，如gamma;-干扰素（interferon-y，IFN-gamma;)、肿瘤坏死因子-alpha; (tumor necrosis factor,TNF-alpha;)、表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)、白介素-17(IL-17) .白介素-27(IL-27）等细胞因子可以通过不同信号通路诱导PD-L1表达[32]。内源性因素，是指癌基因或抑癌基因的改变可导致PD-L1在癌细胞中的结构性表达，如MYC蛋白过表达、RAS癌基因突变、EGFR基因的激活突变均可以上调PD-L1，从而促进肿瘤免疫逃逸。在许多癌症中，肿瘤固有的PD-L1信号通路通常处于异常激活状态，PD-1 / PD-L1途径通过抑制T细胞活化，从而促进肿瘤免疫逃逸。治疗性抗体与PD-1或PD-L1结合可以阻断这种相互作用和反应性癌症的免疫力，Qian等人利用nsPEF诱导PD-L1移位，提高肝癌细胞中膜PD-L1的水平，再合用PD-L1阻滞剂可有效抑制肿瘤生长提高植瘤小鼠的存活率[33]，此外，这在临床上治疗性抗体与PD-1或PD-L1结合在癌症治疗上也已经被证实有效[34]。
主动靶向制剂指能将治疗药物专一性地导向所需发挥作用的部位（靶区），而对非靶组织没有或几乎没有相互作用的制剂。通过表面受体将癌细胞与正常细胞区分开的主动靶向方式对癌症的诊断和治疗至关重要。用特异性识别的分子修饰后，纳米颗粒可以在体内靶向其特异性抗原和肿瘤标志物，从而使抗肿瘤药物定位于肿瘤。因此本课题拟制备一种PD-L1靶向负载索拉菲尼的PLGA纳米制剂，以期在利用纳米制剂改善索拉菲尼生物利用率的同时提高药物的靶向作用，降低肝癌肿瘤免疫逃逸效应，增加患者的治愈率，延长晚期肝细胞癌患者的总生存期。此外，Hage等人发现索拉菲尼的抗肿瘤机理除了抗血管生成和细胞毒性外还具有免疫调节作用，并且借助两种原位HCC小鼠模型以及体外细胞实验发现巨噬细胞（MPhi;）是抗肿瘤作用的关键介质[35]。MPhi;和天然杀伤（NK）细胞之间有强相互依赖性，MPhi;与NK细胞之间借助细胞接触，通过CD154-CD40、NKG2D、2B4-CD48、NKP46-DNAM-1以及免疫突触等多种受体的相互作用来调节NK细胞的功能[36]。在体外将巨噬细胞与NK细胞简单的共培养会增加NK细胞中CD69的表达，表明前者可以在体外激活NK细胞。Martin等人用索拉非尼处理从HCC组织中分离的肿瘤相关巨噬细胞(TAM)，并与自体NK细胞共培养，发现索拉非尼可触发TAM的促炎活性，并以细胞因子和NF-kappa;B依赖的方式诱导抗肿瘤NK细胞反应[37]。基于此，本课题还将进一步探究PD-L1与索拉菲尼在通过免疫调节实现抗肿瘤效应方面是否有协同作用。
二、拟解决的问题
索拉菲尼作为治疗晚期肝癌的一线药物，口服生物利用率较低并且长期服用有较大的毒副作用，本课题拟构建PD-L1靶向负载索拉菲尼PLGA纳米制剂，借助纳米制剂降低药物毒性、刺激性以及给药频率、延缓药物降解的同时，通过PD-L1将其靶向递送至肿瘤微环境中，以加强索拉菲尼递送的靶向性和提高索拉非尼的疗效，延长肝癌晚期患者的总生存期，同时探究PD-L1与索拉菲尼在通过免疫调节实现抗肿瘤效应方面是否有协同作用。
三、研究手段
以上是毕业论文文献综述，课题毕业论文、任务书、外文翻译、程序设计、图纸设计等资料可联系客服协助查找。
