开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）
具有抗菌活性的放线菌分离
海洋药学 0944419 刘勇
摘要：自Wakksman和Umezwa发现放线菌多种用途的多样性后， 人们还发现放线菌作为抗生素、维生素、酶和酶抑制剂的重要产生菌， 形成以抗生素工业为首的巨大现代生物技术产业。本实验即是从我校江宁区校园内采集土样，先分离出相关放线菌，并初步检测其是否具有抗菌活性，为新的抗生素的获得作前期研究。
关键词：放线菌 分离 抗菌活性
放线菌与人类的关系极为密切， 许多放线菌都能产生生物活性物质，如抗生素、有机酸、氨基酸、维生素、甾体、酶及酶抑制剂、免疫调节剂等，放线菌是抗生素的主要产生菌，世界上大约70%的抗生素来自放线菌，尤其是链霉菌和小单孢菌， 是一类具有广泛实际用途和巨大经济价值的微生物资源。放线菌在自然界分布广泛，海洋、土壤、植物体内以及一些特殊的环境等都有分布。土壤是放线菌生长的良好场所， 许多具有应用价值的放线菌大多来源于土壤。但放线菌易受到土壤其他微生物的影响， 所以， 尽可能分离不同种类放线菌， 排除其他微生物如细菌、真菌的干扰， 创造有利于放线菌生长的条件。
放线菌的分离首先进行的就是土壤的预处理，土样的预处理是放线菌分离工作中至关重要的一环，在与处理方法中土样的风干与加热处理是在杂菌抑制中较为常用的两种预处理方法，这在国内外都研究得比较多。姜成林等将土样在室温条件下风干20d 后研碎过筛，结果表明，土样中90%的细菌被杀死，同时对放线菌的出菌率也有很大的提高。司美茹等研究采用了同样的与处理时间，改变了不同的预处理温度作比较，结果表明，一定时间的加热预处理能较好地抑制细菌的数量，并可以促进放线菌的孢子萌发。在加热处理方面，母连军等把土样在120℃下加热1h，不仅可以更有效地去除细菌和真菌，并且可以促进放线菌孢子萌发以及分离耐高温放线菌，比如小双孢菌、高温单孢菌等。史学群等将室温下风干1 ～ 10d 处理与120℃加热1h 处理的效果进行比较，结果表明风干处理得到的放线菌种类和数目均多于加热处理，因此怀疑由于加热处理温度过高杀死了部分不耐热的放线菌。闫建芳等将室温下风干的土样分别进行40、60、80、100、120℃加热处理1h，结果表明，放线菌的种类和数量随着对土样加热处理温度的升高而增多，其中100℃加热处理的土样获得放线菌数量最多。郑雅楠等将土样进行了室温下风干10d、室温下风干20d、50℃下加热1h 与120℃下加热1h 等处理，结果发现室温下风干10d 与20d 土样中放线菌数目无明显变化，20d 处理的土样中细菌菌落数较少; 在120℃高温处理1h 后的土样中，真菌、细菌以及放线菌全部被杀死; 在50℃高温处理1h 后的土样中，细菌数量较多，影响放线菌的分离效果，根据研究结果，他们认为室温风干10d 或者20d 的处理效果要好于高温加热处理。Nonomura H 等采用有机物质溶液处理土样的方法分离放线菌，例如使用6% 酵母膏溶液处理土样中促进放线菌孢子萌发而分离到新放线菌种属。杨宇等将土样与碳酸钙以10: 1 的比例混合，他们认为这样可以促进瓜类枯萎病拮抗性放线菌孢子萌发以进行筛选。闫建芳等分别用0． 01%、0． 05%、0． 10%、0． 20% SDS溶液处理风干后的土壤样品20min，结果发现其中用0． 05%SDS 处理的土壤样品所获得的放线菌数量较多，并且细菌和真菌也得到了较好的抑制。郑雅楠等用酵母膏、蛋白胨与SDS 处理土壤悬浮液，并进行振荡培养。认为这样有利于土壤种放线菌孢子的萌发。结果发现，在土壤悬浮液中加6% 酵母膏以及0． 05%SDS 并在40℃振荡培养20min 的分离方法可以较好地分离放线菌，而经过在土壤悬浮液内加入6% 蛋白胨、0． 05% SDS 并于50℃下振荡培养10min 的处理后分离效果也有很大提高。来航线等利用2% 的腐殖酸溶液和1% 的酪蛋白水解物溶液处理土样， 40℃振荡20min，这种分离方法得到的放线菌数量较对照增加了22． 77%和17． 08% 。
其次，放线菌的培养过程也非常重要，放线菌分离培养基中的营养物质对于放线菌的分离效果有着重要影响。一种培养基中不可能含有适合所有放线菌生长的营养物质，因此如何改变培养基中各营养物质的组分含量是关系到放线菌分离工作成败的关键，必须在实际分离中根据自己的目的不断改变培养基成分，以便更好地分离到目的放线菌。闫建芳等利用7 种不同的分离培养基对土壤拮抗放线菌进行分离，结果表明，在7 种培养基中高氏一号培养基、淀粉琼脂培养基以及HVG 培养基分离效果明显好于其他培养基。司美茹等利用高氏一号等8 种培养基进行放线菌分离工作。结果表明在8 种培养基中，营养物质比较全面的培养基有高氏一号培养基以及秸秆腐解物培养基两种，仅仅使用这两种培养基就可以从土壤中分离到绝大部分的放线菌; 因此他们认为高氏一号培养基和秸秆腐解物培养基所分离的放线菌基本上能反映土壤种放线菌资源信息。来航线等使用高氏一号等9 种培养基对特殊环境中的放线菌进行稀释平板法分离，并观察每个梯度的平板上细菌、真菌以及放线菌的生长情况，并比较不同分离培养基的分离效果，结果发现高氏一号培养基分离该土样所获得的放线菌种类及数量最多。此外，用葡萄糖－ 天门冬氨酸培养基和精氨酸－ 甘油培养基所分离得到的放线菌种类和数量均显著高于其他基础培养基。Nonomura H 等人利用腐殖酸( Hv) 为分离培养基主要成分，再辅以一些化学试剂来分离放线菌，可分离到指孢囊菌、小双孢菌、小四孢菌、孢囊链霉菌等多种稀有放线菌。
放线菌分离工作中，在培养基中加入一定的杂菌抑制剂可以有效降低细菌和真菌的数量，从而减少它们对放线菌分离的干扰。大量细菌生长在一起能形成菌苔，会严重影响放线菌的挑取; 而真菌蔓延速度迅速的特点也使其成为放线菌分离工作的障碍。因此如何有效地抑制细菌和真菌的生长，是杂菌抑制方法主要需要解决的问题。司美茹等以不同浓度重铬酸钾、青霉素以及链霉素组合加入高氏一号培养基中进行放线菌分离效果比较，结果发现在放高氏一号培养基中加入75mu;g /mL K2Cr2O7以及2mu;g /mL 青霉素可显著抑制细菌和真菌生长，且不影响放线菌数量和种类。此外他们还采用了化学抑制剂与加热的联合处理，结果表明，用这种方法分离出的细菌数量比纯化学抑制剂明显减少，而放线菌数量和种类较纯化学抑制剂明显增加。郑雅楠等也用不同浓度的K2Cr2O7对土壤中的放线菌进行分离，结果发现浓度为150mu;g /mL 的K2Cr2O7分离效果最好。史学群也研究了不同浓度的K2Cr2O7对分离放线菌的影响，他研究的结果显示使用50mu;g /mL K2Cr2O7时放线菌分离效果较好，对杂菌的抑制也比较明显。闫建芳等使用常见几种抑制剂进行试验，结果发现链霉素不适合作为放线菌分离过程中的杂菌抑制剂，而1mu;g /mL 青霉素抑制杂菌效果相对明显。
附具体的实验步骤：
采样。
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