ATP响应型基因复合物的制备与理化性质研究
一、研究背景
近年来，从基因水平探索疾病的有效治疗方法成为研究热点。RNA 干扰是公认的细胞调节基因表达的关键机制，可有效的用于疾病治疗。其中，siRNA是人工合成的 21-23 个核苷酸组成的双链RNA，可与细胞质中若干个蛋白组成的沉默复合体结合，导致靶基因沉默。基因治疗的关键环节在于找到合适的基因载体。原因有三，首先，在基因的递送过程中，游离的基因极易受血清和胞内核酸酶降解，使其无法发挥治疗效果。其次，基因和细胞膜表面均带有负电荷，由于电性相同，基因难以跨膜入胞。除此之外，游离基因粒径较大，难以通过内吞作用摄取。故采用合适的基因载体来压缩并保护基因对于基因递送的有效性至关重要。
基因载体按材料来源可分为病毒载体和非病毒载体。病毒载体虽研究应用较早，但因其自身安全性等原因，使其应用受限。非病毒载体不仅更安全，且有着简单经济、易于修饰等优点，具有更大的开发潜力。非病毒载体主要包括阳离子脂质体和阳离子聚合物。
近年来，阳离子基因载体由于无免疫原性、水溶性好及DNA保护能力强等诸多优点备受科研工作者的青睐。其中，聚乙烯亚胺（Polyethylenimine,PEI）是一种最为常见的阳离子聚合物基因载体，凭借其较高的表面胺基密度和良好的细胞摄取以及溶酶体逃逸能力，使其具有较高的基因转染效率。PEI和基因可以通过静电作用形成带正电的基因复合物，从而屏蔽基因负电荷并且起到压缩基因的作用。基因复合物通过内吞作用入胞形成内涵体，之后内涵体形成溶酶体。由于PEI含有大量可质子化的氨基，质子泵持续提供质子进入封闭溶酶体内与之结合，从而引发氯离子内流进入溶酶体内中和多余的电荷；此时，溶酶体内部的渗透压增大，可吸收大量水，从而胀破溶酶体，最终使复合物及时逃逸进入细胞质。这种复合物从内涵体逃逸的机制被称为质子海绵效应。另外，阳离子聚合物对于溶酶体内的酸性环境具有缓冲能力，能保护其携带的基因不被溶酶体中的酶破坏。高分子量PEI（例如25kDa）具有很好的基因转染率，但却因生物降解性差引起严重的细胞毒性而存在安全隐患；[1、2]低分子量PEI毒性虽小，但因基因压缩能力有限而使得转染率偏低。因此，有必要结合高、低分子量PEI的特点，合理设计PEI聚合物，使其兼具高转染效率和低毒性。
二、研究概括
基于高、低分子量PEI的特点，目前常采用化学键合法将低分子量PEI通过刺激响应型化学键交联成高分子量PEI，在病理或外加刺激信号作用下实现基因的快速释放，以平衡聚合物的安全性和基因转染效率。[3、4、5]
苯硼酸（phenylboronic acid，PBA）是一种具有ATP响应型的二元醇类物质识别体，在水溶液中以疏水分子型和亲水离子型结构共存，二者存在可逆解离平衡。[6、7]其亲水型结构可与具有顺式二元醇结构的多羟基化合物，如ATP等形成硼酸酯结构。[8]然而，PBA及其衍生物一般都具有较高的pKa（8~9），在正常的生理环境下主要以疏水性分子结构存在，可作为客体分子用于超分子组装中。[9、10]
环糊精（Cyclodextrin,CD）是天然可降解的环状低聚糖，由六个、七个或八个吡喃葡糖苷单元组成，通常称为alpha;-，beta;-或gamma;-CD。[11]CD与疏水客体分子的络合能力使其在超分子化学中备受关注。Kiminobu Nakamura等人发现，疏水型PBA分子可进入alpha;-环糊精的空腔，二者间可通过主客作用力形成连续的头尾交联型超分子结构。[12、13]
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