开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）
一、拟研究或解决的问题
当免疫细胞识别出感染的一般标志物（如LPS）时，非特异性免疫便会发挥作用，其中炎性小体是非特异性免疫的重要组成部分。炎性小体是一种多蛋白复合物，在非特异性免疫反应中，炎性小体会在免疫细胞中聚集，它能够识别病原相关分子模式或者宿主来源的危险信号分子，招募和激活促炎症蛋白酶caspase-1，活化的caspase-1切割并激活炎症蛋白（如IL-1beta;），产生成熟的细胞因子。已经有报道指出线粒体可以调节免疫细胞对感染和组织损伤的反应，通过改变代谢产物水平[1,2]或改变活性氧的水平[3,4]来产生促炎或消炎信号。不难想到，在非特性免疫反应中，线粒体可能与炎性小体之间存在某种联系。
目前已被充分研究的是存在于巨噬细胞中的NLRP3炎性小体。NLRP3炎性小体的激活取决于功能上不同的两个步骤：“引发”和“激活”。“引发”过程是指与病原体或损伤相关的分子（如LPS）与巨噬细胞表面受体蛋白TLR4结合后，通过增强NF-kappa;B 通路的信号传递，导致NLRP3和 IL-1beta; 前体的表达增加[5]。而炎性小体的“激活”过程可被多种分子触发，有研究表明这些分子最终可能通过提高线粒体内ROS（用来氧化线粒体DNA）水平和促进氧化线粒体DNA（与炎性小体结合）释放的途径发挥作用[6]。CMPK2是线粒体合成dCTP所必需的，是线粒体DNA合成的限速酶。该研究指出LPS与TLR4的结合激活了MyD88/TRIF依赖性信号级联，激活了转录因子干扰素调节因子1 (IRF1)并诱导CMPK2的表达，因而促进了线粒体DNA的合成。新合成的线粒体DNA被线粒体内的活性氧（ROS）氧化，氧化线粒体DNA离开线粒体，与胞质中的NLRP3炎性小体结合，从而激活炎性小体，活化的炎性小体激活caspase-1，从而产生成熟的炎症蛋白（如IL-1beta;），引发炎症。
CMPK2是线粒体中一种限速型核苷单磷酸激酶，属于一个新的核苷单磷酸激酶家族，该家族与胸苷酸激酶的亲缘关系较近，而与胞质 UMP-CMP 激酶的亲缘关系较远。人CMPK2由449个氨基酸组成，根据序列的性质，可以将其分为两个结构域：N-末端结构域和C-末端结构域。其C末端结构域包含核苷酸磷酸激酶的所有共有序列，N端包含信号肽结构。绿色荧光蛋白融合蛋白亚细胞定位表明CMPK2位于细胞线粒体[7]。CMPK2以 ATP 为磷酸供体，能磷酸化 dUMP、 dCMP、 CMP 和 UMP，参与线粒体核苷酸的补救合成途径，其磷酸化 dUMP 的效率最高，其次是 dCMP，动力学性质与胞质 UMP-CMPK激酶不同。CMPK2还能磷酸化核苷类似物 ddC、 dFdC、 araC、 BVDU 和 FdUrd 的单磷酸形式，这表明 UMP-CMPK2可能参与了长期使用 ddC 或其他嘧啶类似物引起的线粒体DNA损耗。
CMPK2在白血病细胞中高表达，在骨髓中具有表达优势，与巨噬细胞活化和炎症反应密切相关，提示UMP-CMPK2除了为线粒体DNA合成提供底物外，还可能具有其他功能[7]。有报道指出CMPK2基因（位于2号染色体上）是干扰素刺激基因（ISG），CMPK2具有抑制HIV的能力，有望作为治疗HIV的新靶点[8]。关于CMPK2的抗病毒活性，在鱼类身上也有相关报道，过表达和RNA干扰实验表明CMPK2在SVCV感染的FHM细胞中具有明显的抗病毒作用[9]。有趣的是，长的非编码RNA-CMPK2（lncRNA-CMPK2）可以部分抑制某些抗病毒ISG的转录，从而成为干扰素反应的负调节剂[10]。也有研究指出，lncRNA-CMPK2在体内外均促进了大肠癌细胞的增殖，突出了其作为结直肠癌晚期生物标志物和治疗靶标的潜力[11]。另外，blast和系统发育分析的结果表明，从鱼类到哺乳动物，CMPK2是高度保守的分子，表明CMPK2在鱼类中可能与在高级脊椎动物中具有相似的功能[12]。该研究还指出，三倍体鲫鱼CMPK2（3nCMPK2）的表达在细菌感染中上调，并且3nCmpk2的过表达保护了肠屏障，并阻碍了鱼组织中细菌的克隆。同样在鱼类中，也有报道指出CMPK2在被寄生虫感染后以及在注射LPS和Poly（I：C）后被上调[13]。
目前对CMPK2的研究尚处于起步阶段，多数研究集中于其生物学功能和作用机制，然而对CMPK2的结构的相关研究目前尚未有过报导。本课题旨在获得可用于 X 射线衍射的 CMPK2单晶，解析CMPK2结构，基于CMPK2结构阐明相关机理，并根据CMPK2结构设计小分子抑制剂。
二、研究手段
首先是采用基因工程技术手段，构建基因表达载体。对于蛋白表达，首选原核表达，如果原核表达目的蛋白存在困难，我们将采用昆虫细胞表达系统进行目的蛋白表达。使用Ni-NTA亲和层析柱初步分离纯化目的蛋白，并利用SDS-PAGE检验蛋白纯度。根据后续实验需要可采用离子交换、亲和层析、分子筛等方法对蛋白进行进一步纯化，以获得纯度95%以上的高质量蛋白。之后利用 ADP-Glotrade;激酶测定法对最终纯化的CMPK2蛋白进行激酶活性测定，确保蛋白结构是其天然构象。用获得的高质量蛋白制备CMPK2蛋白样品，进行结晶条件筛选及优化，将获得的CMPK2晶体进行结构解析。在解析结构后，依据结构设计一系列的突变，将得到的突变体进行蛋白表达与纯化，再次进行激酶活性测定。此外，依据解析结构，对CMPK2的活性口袋和底物结合位点进行分析，参照前人已经发表的结果，采用Ducking的方法进行新型小分子靶向药物的设计，初步筛选出结合能力较强的小分子靶向药物，再通过体外酶活性实验研究其对CMPK2激酶活性的影响，筛选出对酶活性影响较大的小分子靶向药物，最后进行细胞验证。
三、参考文献
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