开题报告
拟研究或解决的问题
- 研究背景
近年来，癌症的免疫疗法越来越热门。2017年FDA批准第一个CAR-T细胞药物上市后，CAR-T细胞疗法成为癌症免疫疗法中最为热门的一种，被认为是一种非常有前景的，能够精准、快速、高效，且有可能治愈癌症的新型肿瘤免疫治疗方法。CAR-T疗法，全称是Chimeric Antigen Receptor T-CellImmunotherapy,嵌合抗原受体T细胞免疫疗法。其主要原理是，从癌症病人身上分离免疫T细胞，利用基因工程技术为T细胞引入一个能够识别肿瘤细胞并同时激活T细胞的嵌合抗体，也就是制备CAR-T细胞，再将扩增好的CAR-T细胞回输到病人体内，通过免疫疗法对抗癌细胞。
制备CAR-T细胞过程中，需要将外源的CAR基因导入T细胞内，目前常用的外源基因导入方法有病毒载体、质粒载体等。病毒载体包括gamma; -逆转录病毒载体和慢病毒（lenti virus）载体已被广泛应用于将基因转移到T淋巴细胞中，其转导效率平均为30% - 80%，这些病毒载体可以整合到宿主基因组中，导致转基因永久表达。然而，高质量病毒颗粒的制备和转导是一个劳动密集型、耗时的过程，技术要求很高
质粒载体通过限制性核酸内切酶将CAR基因连接到质粒上，然后将质粒导入T细胞中，能够实现瞬时转染和长期转染，但是质粒不会整合到宿主基因组中，因此无法永久表达。目前常用的将质粒导入细胞的方法为电穿孔法、显微注射、脂质体载体等。电穿孔是一种相对于病毒颗粒传递的更快、理论上更安全、更经济的方法，已经建立了用于T细胞的方法。
电穿孔法原理是高强度电脉冲引发细胞膜结构一过性改变，致暂时可逆性膜渗透性增加，膜上出现亲水性孔道，即电穿孔(electroporation)也，其可促进非渗透性外源性大分子物质，诸如基因、药物等进入细胞内。但是，电穿孔的条件对转染效率和细胞活率影响很大，且在不同细胞中的最适条件并不一致。因此在进行电穿孔转染前应对各种因素做对照研究以优化电穿孔转染效率。
采用的研究手段
1.细胞选择
使用大肠杆菌进行质粒的生产。
细胞选用液氮冷冻保存的人外周血单个核细胞（PBMC）。
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