- 文献综述
AMA合酶C端功能研究 综述
由于抗生素的大量使用，beta;-内酰胺类抗生素的耐药性已经成为一个全球性的公共卫生问题。现今主要使用的beta;-内酰胺类抗生素主要有青霉素类、头孢菌素类、单环beta;-内酰胺类、碳青霉烯类等。细菌对beta;-内酰胺类抗生素产生耐药性的机制主要有：（1）通过改变细胞壁或外膜通透性，使抗生素难以进入细胞而难以与靶点结合（2）减弱抗生素与靶蛋白的亲和力（3）改变抗生素结合位点（4）产生beta;-内酰胺酶，水解beta;-内酰胺环。beta;-内酰胺酶主要通过两种机制发挥作用：一种是将beta;-内酰胺环水解，使抗生素失效；另一种是与抗生素紧密结合，使抗生素停留在包膜外间隙，无法进入细胞与靶点结合（主要为对beta;-内酰胺酶稳定的广谱青霉素以及第二、三代头孢菌素）。beta;-内酰胺酶主要有两种，分别为丝氨酸beta;-内酰胺酶和金属beta;-内酰胺酶（MBLs）。它们分别依赖丝氨酸和金属离子对beta;-内酰胺环进行水解[1]，其中针对于丝氨酸beta;内酰胺酶的抑制剂已经被广泛研究并产生了临床上的复方制剂如经典的青霉素 克拉维酸（奥格门汀）、头孢菌素 舒巴坦（头孢哌酮）[2]，而针对于金属beta;内酰胺酶的抑制剂的研究与复方制剂的开发起步较晚，且尚未有上市药物。代表性MBLs新德里金属-beta;-内酰胺酶1(NDM-1)和VIM-2是全球流行的细菌多重耐药性公认的重要来源，能够水解青霉素类、头孢类、碳青霉烯类抗生素，可通过质粒在菌种中传播，具有高度传播性。研究和发现MBL抑制剂，开发安全、有效的beta;-内酰胺抗生素/金属-beta;-内酰氨酶抑制剂复方药物，是临床上的迫切需求与基础研究的重要方向。
Aspergillomarasmine A（AMA）是一种来自于真菌的天然产物，该化合物在2014年被重新发现其具有选择性抑制MBLs的功能[3]，能够在体内或体外通过抑制金属beta;-内酰胺酶来增强beta;-内酰胺类抗生素的功效。它能够以类似于螯合剂的机制夺取金属beta;-内酰胺酶的Zn2 ，从而抑制MBLs的活性。AMA在报道中被证明其在体外具有选择性，体内实验表明它对家兔肺部ACE的影响也很低，具有良好的选择性，对小鼠毒性低、耐受性好[3]，是一种解决MBLs的无毒的抗生素佐剂的良好候选药物。
虽然AMA被认为是一种很好的解决MBLs的候选药物，但它的获取一直让全世界科学家困扰。多年以来，科学家们都未能发现能够用于合成AMA的关键蛋白。无法用生物合成的方法获得AMA，于是科学家们着眼于对AMA设计全合成路线。例如有一项研究报道了一种AMA的全合成路线[4]，作者首先利用逆合成法将AMA分解成一个Asp和两个氨基丙酸（APA1和APA2）单元，然后设计出了一种改进的运用磺胺酯方法的全合成路线。该合成路线共有4步，能够用于合成AMA及其相关化合物。作者还通过构效关系验证，发现了羧基结构、APA2单元等基团对AMA及其类似物的功能具有十分重要的作用，这给我们后续对AMA的改造提供了参考。
去年有研究报道发现并鉴定一种米曲霉菌中合成AMA的关键酶，并命名为AMA合成酶[5]，它是一种PLP依赖的半胱胺酸合成酶同源蛋白，能以L-天冬氨酸以及O-乙酰-L-丝氨酸或O-磷酸-L-丝氨酸作为底物，催化两个连续的C-N键形成，从而合成AMA。该酶经过结构分析得知其具有两个主要结构域——N端的PLP依赖的半胱胺酸合成酶同源序列和C端的Rhodanese同源结构域。在这篇报道中，作者将AMA合成酶C端的Rhodanese结构域切除后，该酶无法催化AMA的合成，因此推测Rhodanese结构域是AMA合成酶发挥生物活性的一个必需结构域。
Rhodanese同源结构域是一种古老的结构域，在古细菌、真细菌、和真核生物基因组中均有发现[6]。在过往的研究中，Rhodanese同源结构域主要被认为具有转硫酶功能，这类结构域在C端有一个高度保守的催化性Cys残基，而这个残基在N端往往被Asp或Gly取代。因此，有报道提到，对于TSTs（串联结构域蛋白），由两个Rhodanese结构域构成的蛋白，其N端的Rhodanese结构域是不具有催化活性的，催化功能由C端Rhodanese结构域承担[7]。对于转硫酶，可以分为四类：（1）单结构域蛋白；（2）串联结构域蛋白；（3）多结构域蛋白；（4）活性位点环改变的蛋白。以硫代硫酸盐硫转移酶TSTs和巯基丙酮酸硫转移酶MSTs为代表的含Rhodanese结构域的转硫酶属于第二类，TSTs能够以硫代硫酸盐，而MSTs以3-巯基丙酮酸（3-MP）为主要底物经过高度保守的半胱氨酸残基形成过硫化物中间体，将S转移生成亚硫酸盐、H2S。其中较为经典的是以硫代硫酸盐为S供体，氰化物为S受体，通过从牛肝脏获得的rhodanese蛋白结晶催化生成亚硫酸盐和硫氰酸盐（氰化物的解毒）[8]。在一篇报道中还提到，具有Rhodanese同源结构域的Cdc25磷酸酶能够催化磷酸化反应，它可以催化O-磷酸-酪氨酸蛋白生成磷酸和L-酪氨酸[9]。另有研究报道了一种存在于斑马鱼体内的TBC1D23蛋白的N端结构，该结构含有一个存在于C端但没有起催化作用而是参与亚细胞定位和细胞功能的rhodanese结构域[10]，作者通过结构和生化分析推测TBC1D23N端的rhodanese结构域可能不具有酶活性，但在构建只包含rhodanese结构域的蛋白并试图单独研究其功能时时只能获得不溶性蛋白或可溶性聚集体。因此推测该蛋白的TBC结构域与Rhodanese结构域相互稳定。此后该报道作者通过对Rhodanese结构域中表现酶催化活性的关键序列（Cys残基）进行突变，发现突变并未改变蛋白整体的活性，因此确定了Rhodanese结构域并未起到催化作用，而是作为一种蛋白发挥功能的必需基团起作用。此外还有一篇研究报道了一种来自于结核杆菌的，由两个rhodanese结构域串联构成的CysA蛋白[7]，这种蛋白具有TST和MST的双重功能，能够同时将硫代硫酸盐和3-MP作为底物。但作者通过酶动力学分析，参考Km值的分子量顺序，指出硫代硫酸盐和3-MP都不应该是这种蛋白的天然底物。有趣的是，有一篇文献报道了一种发挥砷还原功能的Rhodanese结构域[11]，这与我们广泛认为的转硫酶活性和磷酸化酶活性相去甚远。这种来自于酿酒酵母的ACR2蛋白（活性位点为7个关键残基）能够通过一个类似于氧化型谷胱甘肽的中间体将五价砷（砷酸盐）还原为三价砷（亚砷酸盐），推测于酿酒酵母对砷的解毒有关。
根据现有文献参考，我们推测AMA合成酶及其同源蛋白的C端Rhodanese同源结构域可能具有转硫酶活性，该活性可以通过监测Rhodanese结构域作为硫转移酶时的产物的浓度变化或通过荧光监测过硫键浓度来实现。但不得不考虑的是，AMA合成酶催化的反应并未显示出硫的参与，因此其C端Rhodanese结构域对于全酶也可能起到前述报道所提到的参与亚细胞定位和细胞功能的作用。总而言之，AMA合成酶C端Rhodanese结构域是否具有独立活力以及其对于N端及全酶结构及功能的具体作用仍待探究。
- 参考文献
[1] De Angelis G, Del Giacomo P, Posteraro B, Sanguinetti M, Tumbarello M. Molecular Mechanisms, Epidemiology, and Clinical Importance of beta;-Lactam Resistance in Enterobacteriaceae. Int J Mol Sci. 2020 Jul 18;21(14):5090. doi: 10.3390/ijms21145090. PMID: 32708513; PMCID: PMC7404273.
[2] Bush K, Bradford PA. beta;-Lactams and beta;-Lactamase Inhibitors: An Overview. Cold Spring Harb Perspect Med. 2016 Aug 1;6(8):a025247. doi: 10.1101/cshperspect.a025247. PMID: 27329032; PMCID: PMC4968164.
[3] King A M , Reid-Yu S A , Wang W , et al. Aspergillomarasmine A overcomes metallo-beta;-lactamase antibiotic resistance.[J]. Nature, 2014, 510(7506):503-506.
[4] Albu SA, Koteva K, King AM, Al-Karmi S, Wright GD, Capretta A. Total Synthesis of Aspergillomarasmine A and Related Compounds: A Sulfamidate Approach Enables Exploration of Structure-Activity Relationships. Angew Chem Int Ed Engl. 2016 Oct 10;55(42):13259-13262. doi: 10.1002/anie.201606657. PMID: 27633338.
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