一.实验背景
单克隆抗体 (monoclonal antibody, mAb) 是由两条重链和两条轻链组成的复杂四聚体糖蛋白, 其生物合成过程中会发生复杂的翻译后修饰, 纯化和储存过程中会发生不同程度的降解, 修饰和降解会导致mAb出现电荷、疏水、构象等异质性[1]。
单克隆抗体药物的相对分子质量约150 000，作为复杂的大分子物质，在细胞培养、纯化、运输、存储过程中，可能在组成氨基酸、二硫键、糖基化等层面 发生不同程度的变化，进而引起电荷的变化。目前报道的单克隆抗体电荷异质体包括天冬氨酸异构化、天冬酰胺的琥珀酰氨化、蛋氨酸及苯丙氨酸的氧化、末端唾液酸化、C-末端赖氨酸缺失/增加、N-末端谷氨酸环化、半胱氨酸二硫键错配等[2]。
在药品生产工艺控制中，关键质量属性指药品具备的直接或间接影响物质安全、鉴别、强度、纯度的物理，化学，微生物方面的特性，是影响生产工艺稳定性，药物安全性和有效性的重要属性指标。主要包括产品相关的异质性和过程相关的异质性两大类。对于重组蛋白药物而言，其中产品相关的异质性是重组蛋白类药物在生产(包括发酵表达或细胞培养、纯化以及制剂生产)、存储以及使用过程中由于翻译后修饰和降解等引起的蛋白各级结构上的差异，包括多聚化、糖基化、片段化、氧化、去酰胺化、C末端和N末端修饰、二硫键修饰和序列变异等。而过程相关的异质性则是由于宿主菌或宿主细胞本身产生的一类杂质，如宿主蛋白、DNA等。此外，重组蛋白在生产过程中引入的污染物，如细菌、真菌、病毒及内毒素也是一类重要的异质性属性[3]。
各种不同的影响因素均能通过改变电荷基团的数量或结构，使重组蛋白制品的电荷属性发生异质性改变，从而在同一蛋白制品中产生不同的电荷异构体。因此在生产工艺控制中，表征和监测重组蛋白质药物异质性的质量属性时，对于蛋白质电荷异构体的分析和检测非常关键。重组蛋白类药物在生产、存储以及使用过程中往往伴随着多种翻译后修饰和降解的同时进行，共同影响着重组蛋白类药物的表面电荷特性，重组蛋白类药物的电荷异质性是这些翻译后修饰和降解的综合效应。脱酰胺化、N 端修饰、异构化、唾液酸化聚糖和 C 端裁剪等蛋白质修饰作用都会导致电荷异构体的形成。研究表明，这些电荷异构体的存在可能会对重组蛋白类药物的结构和功能造成不同程度的影响，并直接影响到重组蛋白类药物的结合能力、生物学活性、药代动力学、免疫原性以及结构稳定性等，进而对药物在临床使用时的有效性、安全性和保质期产生不同程度的影响。同时，电荷异质性的控制程度也反映了重组蛋白类药物生产工艺的一致性。因此，在生物类似药的研发及与原研药的一致性评价研究中，电荷异质性是工艺质量控制的重点因素[4]。
二.目的
建立注射液电荷异质性纯度分析方法并对样品电荷变异体进行解析。通过不同条件的优化，获得最佳的分析条件。我们通过专属性，重复性，准确度对建立的分析方法进行简单确认，确保分析方法满足原液、中间产品及成品的电荷变异体纯度测定。
三.原理
目前，对抗体电荷异质性分析的常用方法有等电聚焦电泳（IEF）、离子交换色谱（IEC）、毛细管区带电泳（CZE）、毛细管等电聚焦电泳（CIEF）和成像毛细管等电聚焦电泳（iCIEF）。等电聚焦电泳（IEF）是根据抗体总的电荷差异进行分离；IEC 中除了总电荷差异外，电荷的分布由于能够影响抗体与色谱柱的相互作用，也会影响电荷变异体的分离检测；CZE 根据样品各组分的质荷比差异进行分离。上述方法均能对单抗样品的电荷异构体进行有效的分离，并具有各自的优势[5]。
离子交换色谱法(IEC) 是发展最早的色谱技术之一。离子交换色谱法（IEC）通过表面带电荷配体的固定相与带相反电荷的分析物之间的相互作用而分离。该技术分为阴离子交换和阳离子交换两种模式。在阴离子交换中，带正电荷的表面配体与带负电荷的分析物相互作用，而在阳离子交换中，带负电荷的表面配体与带正电荷的分析物相互作用。有盐梯度法，在盐梯度的 EC 中，缓冲液 pH 值是固定的。随着离子强度增加，IEC 固定相与蛋白的结合力逐渐降低，因此除起始缓冲液选择合适 pH 值外，还须将起始离子强度保持在较低水平。随后通过增加缓冲液的离子强度（盐浓度），增加缓冲液离子与IEC 树脂上带电基团的竞争，洗脱蛋白。最终，IEC 树脂与蛋白之间的相互作用减弱，蛋白被洗脱出来。还有pH 梯度法，在基于 pH 梯度的 IEC 中，起始缓冲液的 pH 值需保持恒定，以确保蛋白带有与固定相相反的电荷，从而结合到色谱柱上。随着梯度运行，缓冲液的pH 值发生改变，蛋白不带电荷即（p=0），并最终与树脂携带同样的电荷，从而被释放并从柱中洗脱[6]。
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