开题报告
一、课题的来源与选题的依据
据世界卫生组织发布，乳腺癌（breast cancer, BC）已超过肺癌成为全球最常见癌症。在以化疗和手术为主要治疗方法的背景下，肿瘤复发和耐药是影响患者治疗和生存的主要因素。肿瘤干细胞（cancer stem cells， CSCs）是肿瘤中具有自我更新能力并能产生异质性肿瘤细胞的细胞，对肿瘤的存活、增殖、转移及复发有着重要作用[1]。一方面，肿瘤干细胞通过自我更新和无限增殖维持着肿瘤细胞群的生命力；另一方面，肿瘤干细胞的运动和迁徙能力又促成了肿瘤细胞的转移；另外，肿瘤干细胞可以长时间处于休眠状态并具有多种耐药分子而对杀伤肿瘤细胞的外界理化因素不敏感，致使肿瘤复发和获得性耐药[2]，对癌症治疗实现持久反应造成威胁。有研究者表明，癌症恶化过程中，肿瘤内肿瘤干细胞比例的增加与上皮-间充质转化（epithelial-to-mesenchymal transition，EMT）的激活密不可分，即经EMT这一复杂的转分化过程，肿瘤细胞可获得干性成为肿瘤干细胞样细胞[3]。
蛋白质作为生命功能的主要执行物质，其功能研究一直备受青睐，其中，蛋白质翻译后修饰（Post-translational modification，PTM）的相关研究是很多研究者们的聚焦点。泛素化（ubiquitination，UB）是蛋白质翻译后修饰的一种常见形式，这一通过三酶级联（E1-E2-E3）最终由E3泛素连接酶催化连接的过程，能够调节不同细胞途径中各式各样的蛋白质底物，它参与了细胞周期、增殖、凋亡、分化、转移、基因表达、转录调节、信号传递、损伤修复、炎症免疫等几乎一切生命活动的调控 [4]。干扰素刺激基因 15( interferon － stimulated gene 15，ISG15) 是 ISGs 家族成员之一，也是第一个被鉴定出来的泛素样蛋白( ubiquitin－like protein，UBL)。1979年，ISG15在经干扰素处理的肿瘤细胞细胞质中首次被发现，在当时被称为“15 kDa蛋白”，其类似泛素化蛋白的性质在1987年被报道，那时研究者发现了“15 kDa蛋白”可与泛素化蛋白的抗体发生交叉反应，且进一步证明了该蛋白由IFN-alpha;、IFN-beta;和IFN-delta;诱导产生，因此创造了术语“干扰素刺激基因”，将其重新命名为ISG15[5,6]。ISG15有两个泛素样结构域，其氨基酸序列和泛素平均有50%的同源性。在生理条件下，ISG15前体蛋白经切割成为15 kDa的成熟形式，暴露出羧基端的LRLRGG基序，ISG15通过这一基序与底物的赖氨酸残基相互识别并结合，完成底物的ISG 化 ( ISGylation) 修饰。与泛素化修饰相似，底物的ISG化修饰由泛素激活酶(E1)、泛素结合酶(E2)和泛素连接酶(E3)顺序催化完成。而底物的去ISG化则由去泛素化酶( deubiquitinases，DUB) 催化完成，USP18( 也叫UBP43) 是人类的特异性去ISG化酶。但和泛素化修饰不同的是，ISG化修饰不会出现多聚链修饰[7]。干扰素调节转录因子3(IRF3)是I型干扰素依赖反应的关键转录调节因子，有研究表明，ISG15与IRF3的结合抑制了蛋白酶体对ISG15的降解，导致人类细胞产生更显著的干扰素反应[8]。这暗示ISG化修饰能够竞争性阻断底物的泛素化降解，通过增加其稳定性影响底物的生物学功能。有研究者以ISG15作为诱饵，通过免疫共沉淀结合质谱分析，获得了三百余个ISG15底物蛋白，一百余个蛋白已被证实，包括p53、NF-kB、KRAS、Cyclin D、PTEN、STAT1、RIG-I及IRF-3等，这些蛋白在病毒复制、炎症发生、细胞增殖分化、肿瘤发生发展过程中发挥重要作用[9,10]。
与正常乳腺组织相比，乳腺癌中ISG15的mRNA和蛋白水平均上调，其过度表达与乳腺癌的不良预后显著相关，暗示ISG15可能是一种潜在的乳腺癌生物标志物。游离型ISG15水平和蛋白质ISG化修饰具有细胞类型特异性，两者似乎都在乳腺癌细胞中起着关键作用。Burks J等人通过体外细胞实验与小鼠体内研究证实，游离型ISG15可以通过增加乳腺癌细胞表面主要组织相容性复合体I型分子(MHC-I)的表达，促进NK细胞向肿瘤组织的浸润，抑制乳腺癌细胞的生长[11]。Burks J等人在 K-ras高表达的乳腺癌中证实 K-ras可以增加ISG15表达，诱导产生的 ISG15可抑制 K-ras 经溶酶体途径降解，从而增加K-ras的稳定性。敲除ISG15连接酶UBCH8，阻断底物发生ISG化修饰，发现由K-ras引发的肿瘤表型被去除[12]，暗示ISG15通过其ISG化修饰在致癌效应中发挥作用，抑制ISG15与底物的结合可能为相关乳腺癌或其他肿瘤的治疗提供帮助。一项研究表明，使用特异性siRNA降低ISG15的表达可减少MDA-MB-231乳腺癌细胞的增殖和迁移， UBCH8(ISG化系统的E2酶)的降低使蛋白质ISG化水平降低，表现出与ISG15降低相似的效果，ISG15表达降低和UBCH8表达降低均逆转了MDA-MB-231乳腺癌细胞的EMT过程[13]。因此，我们猜想ISG15可能具有促乳腺癌细胞干性的作用。
二、研究策略与预期目标
本课题旨在探索ISG15对乳腺癌肿瘤细胞干性的调控作用。
1、构建ISG15过表达质粒，设计并合成ISG15的小干扰RNA（siRNA），并转染乳腺癌细胞系MCF-7和MDA-MB-231，验证过表达效率和敲减效率；
2、通过实时荧光定量PCR、western blot技术检测ISG15对干性标志分子（Oct3/4、ALDH1A1、Sox2、Nanog）表达水平的调控该作用；
3、通过干细胞微球体形成实验，检测ISG15对乳腺癌细胞成球能力的影响；
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