开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）
- 研究背景与意义
血管的生成为肿瘤的生长提供了充足的营养与氧气，与肿瘤的发展息息相关，恶性肿瘤中血管结构和功能异常，营造了异常的肿瘤微环境。抗血管生成药物作用于促血管生成因子或其受体，如VEGF/VEGFR,抑制肿瘤血管生成，从而起到抑制肿瘤生长的作用。在肿瘤细胞上，表达上调的PD-L1与T细胞表面抑制性受体PD-1结合，起到抑制T细胞活性的作用，诱发免疫逃逸。免疫检查点抑制剂通常以PD-1/PD-L1为位点，阻断免疫抑制信号，激活免疫细胞，介导肿瘤杀伤。研究发现，相较于单药使用，抗血管生成药物和免疫检查点抑制剂联合使用能有效提高患者的反应率、抑制肿瘤生长和延长生存期。基于此，本课题致力于构建和制备抗PD-1和VEGFR2双特异性抗体，并研究构建出的双特异性抗体活性。
- 主要研究内容和研究手段
以靶向PD-1 的抗体D00 和靶向VEGFR2 的抗体A00 为亲本抗体，利用PCR 等分子生物技术在IgG4 型抗体两个重链Fc 上分别引入“Knob”（T366W ，S354C 突变）和“hole”(T366S, L368A，Y407V 和Y349C 突变)，在将目的序列整合入真核表达载体pcDNA3.0 后通过瞬时转染HEK293F 细胞，收集细胞培养上清，利用protein A 柱进行纯化，SDS-PAGE 鉴定装配及分子量完整性，HPLC 检测双特异性抗体的纯度。随后利用ELISA和SPR 实验检测抗体同时靶向PD-1 和VEGFR2 的亲和力。最后时间时间充分时初步研究双特异性抗体的抗肿瘤活性。
三、成果要求
完成研究报告和论文；掌握基因构建、细胞培养、蛋白表达和纯化等工作。
四、主要参考文献
1）Schaefer W , Regula J T , Bahner M , et al. Immunoglobulin domain crossover as a generic approach for the production of bispecific IgG antibodies[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2011, 108(27):11187-11192.
2）Tada Y , Togashi Y , Kotani D , et al. Targeting VEGFR2 with Ramucirumab strongly impacts effector/ activated regulatory T cells and CD8 T cells in the tumor microenvironment[J]. Journal for ImmunoTherapy of Cancer, 2018, 6(1).
3）PD-1 blockade induces responses by inhibiting adaptive immune resistance[J]. Nature, 2014, 515(7528):568-571.
4） ZHAO S, REN S, JIANG T, et al. Low-dose apatinib optimizes tumor microenvironment and potentiates antitumor effect of PD-1/PD-L1 blockade in lung cancer [J]. Cancer immunology research, 2019,
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