1.研究背景双特异性抗体是含有2种特异性抗原结合位点的新一代基因工程抗体，能在靶细胞和功能分子(细胞)之间架起桥梁，可以同时结合靶细胞表面的抗原和效应细胞（如T淋巴细胞）表面的触发分子，引发正常的细胞防御机制到肿瘤细胞上来，激发具有导向性的免疫反应，是基因工程抗体的一种，现已成为抗体工程领域的热点，在肿瘤的免疫治疗中具有广阔的应用前景。
本研究以多发性骨髓瘤细胞（MM）表面特征性抗原BOLT蛋白以及功能性T细胞表面的程序性死亡细胞PD-1作为2种特异的靶点制备的双特异性抗体，通过同时结合MM细胞与T细胞而触发T细胞对于MM细胞的攻击，从而达到杀死肿瘤细胞的目的。
2.研究手段①基因的构建本研究拟采用konbs-into-holes技术构建双特异性抗体。
分别构建knob端BOLT重链和轻链，hole端PD-1重链和轻链，并得到其扩增产物，插入pTT5表达载体，完成双特异性抗体工程质粒的构建。
②细胞转染及蛋白的表达纯化将重组质粒通过PEI试剂转染HEK293细胞，收集抗体蛋白上清液。
再通过Protein A亲和层析柱洗脱一步分离纯化目的蛋白，采用SDS-PAGE电泳和western blotting对蛋白的分子量、纯度和装配情况进行鉴定。
③双特异性抗体的靶向性研究使用浓度依赖性ELISA和流式细胞术来检测双抗的靶向亲和性。
在酶标条底部固定BOLT和PD-1抗原，通过孵育不同浓度的二抗，及带HRP标签的检测抗体，验证双抗在分子水平上与两种抗原的结合能力。
培育NCI-H929、MM.1s、OPM-2和RPMI-8226等bolt阳性表达的骨髓瘤细胞系，双抗与骨髓瘤细胞孵育，再用带FITC标记的检测抗体孵育，通过流式细胞仪检测双抗在细胞水平上与Bolt的结合能力。
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