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1.拟研究和解决的问题 VEGFR2是一种血管内皮细胞生成因子受体，促进肿瘤细胞的生长、转移；NKG2D是NK等淋巴细胞表面表达的一种蛋白分子，NKG2D的配体主要高表达在肿瘤细胞表面，NKG2D与其配体结合可活化NK细胞活性而杀伤肿瘤细胞，而达到免疫监视的作用，但由于其主要配体MICA存在可溶性形式而对NKG2D的表达有下调作用，致肿瘤细胞发生免疫逃逸。本课题通过表达纯化鉴定靶向VEGFR2和NKG2D的双特异性抗体JZC01，并对非小细胞肺癌的体外巨噬细胞免疫激活以及转型进行研究，为解决非小细胞肺癌的靶向治疗问题提供一定的帮助与启发。 2.采用的研究手段 （1）通过瞬时转染技术将JZC01质粒转染到HEK-293细胞中表达双特异性抗体。 （2）通过镍柱纯化JZC01，SDS-PAGE鉴定其分子量，通过Western blot鉴定其结构。 （3）通过将非小细胞肺癌细胞株和小鼠巨噬细胞共孵育，通过Western blot和qPCR检测巨噬细胞的细胞因子的释放，从而研究JZC01对巨噬细胞转型的影响。 3.文献综述 近年来,肿瘤的发生发展严重危害了人类的健康,如何预防与治疗这些疾病是一直亟待解决的健康问题。而在这些疾病的发病与治疗机制中,血管新生发挥重要作用。由组织中既存的成熟血管的内皮细胞发生增殖和游走,逐渐分化重构形成新的小血管的过程,叫做血管新生(angiogenesis)[1]。在正常情况下血管新生仅发生在胚胎发育期,创伤愈合期等。而病理条件下会出现异常的血管新生,过度的血管生成在肿瘤的生长过程中表现尤为明显。以肿瘤血管内皮细胞为靶点抑制肿瘤血管生成，从而阻断肿瘤血液供应已成为当前抗肿瘤生长和转移的研究热点，其中VEGFR/VEGFR2信号转导通路在肿瘤周围血管生成起主要作用[2]，阻断该信号通路，对抑制肿瘤新生血管生成，从而抑制肿瘤细胞的生长、增殖、迁移起到至关重要的作用。 VEGFR是VEGF的主要功能受体。VEGFR2是一种酪氨酸激酶受体，由一个胞外结构域、一个跨膜结构域和一个胞质内酪氨酸激酶结构域组成，其胞外结构域含7个免疫蛋白样袢[3]。VEGFR2胞外段是VEGFR2与其配体VEGF相结合的部位，VEGFR2胞外第1个袢是与VEGFR2结合的必要部位，第2-3袢是与VEGF紧密结合的主要部位，受体通过第4个样区形成同源二聚体的活性形式，而第5-7袢与VEGF结合的关系不密切[4]。VEGFR2与VEGF结合，形成二聚体及酪氨酸发生自身磷酸化，激活并将细胞膜/细胞质激酶级联反应信号传递到细胞核，可引发内皮细胞的一系列变化，包括钙离子内流、IP3的增加、VonWillebrand因子的释放以及胎儿血管内皮金属蛋白酶、凝血酶的产生，诱导整合素的表达，调节与纤维蛋白溶解和凝固相关的因子在内皮上的表达，如Vwf、组织因子。这些级联反应通过抗凋亡等机制调节内皮细胞的存活，促进新生血管形成并维持其完整性[5]。另外，VEGF刺激VEGFR2，介导肿瘤血管内皮细胞DNA合成和增殖，VEGF诱导内皮细胞的增殖、迁移，VEGFR2还参与VEGF介导的血管通透性改变[6]。 NKG2D是NKG2家族的成员,为Ⅱ型 C-凝集素样受体,在所有NK 细胞、CD8 T 细胞及绝大多数NKT细胞和gamma;delta;T细胞上都有表达[7],是一个重要的激活性受体。NKG2D配体主要在大多数上皮源性肿瘤细胞上表达,如卵巢癌、结肠癌、白血病等,在正常细胞上 表达极少。NKG2D无需抗原呈递即可直接识别肿瘤细胞表面表达的配体分子,进而激活或协同刺激免疫效应细胞,从而发挥对肿瘤细胞的杀伤作用[8]。越来越多的证据表明,NKG2D/NKG2DL通路在许多恶性肿瘤的发生发展中的作用不可或缺[9]。NKG2D 可与许多不同的配体结合, 这些配体属于主要组织相容性复合体Ⅰ类( MHC-Ⅰ)相关蛋白[7]，MICA为主要的配体。NKG2D与MICA结合，激活NK、CD8 T细胞识别肿瘤细胞并发挥杀伤力而抑制肿瘤细胞的生长。但是，依旧有许多肿瘤发生，这是因为发生了肿瘤细胞逃逸现象，即免疫系统未能完全正确识别异我。研究发现这主要是因为MICA分为膜型MICA和可溶性MICA，膜型MICA与NKG2D结合可以促进免疫淋巴细胞对肿瘤细胞的杀伤作用，随着肿瘤恶性程度增加，膜型MICA水解脱落成为可溶性MICA，可溶性MICA与NKG2D结合后增加NKG2D的内吞降解[8]，可能下调了NKG2D的表达，肿瘤抗原特异性T细胞功能被抑制。另外，某些细胞因子如IFN-alpha;、TGF-beta;等也可下调NKG2D受体表达，使肿瘤细胞逃避免疫攻击[10]。 抗VEGFR2单抗虽然有一定抗肿瘤作用，但在一定程度上受到限制，只有少部分患者表现出持久的反应。靶向VEGFR2和NKG2D的双特异性抗体，即在抗VEGFR2抗体上融合NKG2D配体分子，借助靶向VEGFR2抗体识别肿瘤细胞，通过抗体上融合的NKG2D配体与NKG2D结合，从而聚集和活化NK细胞，在发挥抗肿瘤血管生成的同时也发挥了NKG2D-NKG2DL通路介导的免疫监视作用，相比抗肿瘤单抗，极大地增强了抗肿瘤作用。 本课题包含两部分，一是纯化鉴定靶向VEGFR2和NKG2D的双特异性抗体JZC01，通过转染技术将含JZC01基因的质粒转染到HEK-293细胞中，培养后提取上清，用镍柱的方式纯化目的蛋白，并用SDS-PAGE鉴定分子量、western blot鉴定分子结构。二是通过将非小细胞肺癌细胞株和小鼠巨噬细胞共孵育，通过Western blot和qPCR检测巨噬细胞的细胞因子的释放，从而研究JZC01对巨噬细胞转型的影响。通过初步研究双特异性抗体JZC01，为解决非小细胞肺癌的靶向治疗问题提供潜在方案。 参考文献 [1] 商金艳.Endophilin A2通过激活内皮细胞VEGF-VEGFR2信号和抑制p53细胞凋亡通路促进血管新生及机制[D].2016. [2] 杨军，陈明清，董坚.VEGF/VEGFR2信号转导通路在抗肿瘤血管生成中的作用[J].世界华人消化杂志，2007.15（34）：3611-3616. [3] Shibuya M.Vascular endothelial growth factor receptor-2:its unique signafling and specific fligand,VEGF-E.Cancer Sci 2003;94:751-756. [4] Shinkai A,Ito M,Anazawa H,Yamaguchi S,Shitara K,Shibuya M.Mapping of the sites involved in ligand association and dissociation at the extracellilar domain of the kinase insert domain-containing receptor for vascular endothelial growth factor.J Biol Chem 1998;273:31283-31288. [5] Li B,Fuh G,Meng G,Xin X,Gerritsen ME,Cunningham B,de Vos AM.Receptor-selective variants of human vascular endothelial growth factor.Generation and characterization.J Biol Chem 2000;275:29823-29828. [6] Larrivee B,Karsan A.Signaling pathways induced by vascular endothelial growth factor(review).Int J Mol Med 2000;5:447-456. [7] 郑国强，王芳，整捷，刘安军.NKG2D及其配体在肿瘤免疫中的研究进展]J].China Academic Journal Electronic Publishing House,2009.19(5). [8] 臧怡雯，周易明，陈宗祐.NKG2D及其配体在肿瘤免疫中的研究进展[J].复旦学报（医学版），2011.38（4）. [9] Xuan X Y ,Zhang J F.Hu G M.et al.Upregulatel expression of NKG2D and its ligands give potential therapeutic targets for patients with thymoma[J].Cancer Gene Ther,2015,22(7):368-74. [10]WaldhauerI,SteinleA.NKcellsandcancerimmunosurveillance.[J].Oncogene.2008,27:5932-5958
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资料编号：[380870]
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