立题依据及研究意义：
- 引言
1.1 L-天冬酰胺酶的来源及应用
具有抗肿瘤活性的 L － 天冬酰胺酶是儿童急性淋巴细胞白血病和淋巴肉瘤临床化疗中重要的配伍药物之一。大肠杆菌中的 L－天冬酰胺酶有EC－1 和 EC－2 两个组分，仅EC－2组分有抗癌效果，即L－天冬酰胺酶Ⅱ。白血病细胞和肿瘤细胞在其代谢过程中由于缺少天冬酰胺合成酶而不能合成足够的天冬酰胺，机体摄入的 L－天冬酰胺酶能使血液中的天冬酰胺水解，且不影响正常细胞合成并利用 L－天冬酰胺。
L－天冬酰胺酶的微生物来源非常广泛，包括真菌、细菌和古生菌等，目前已证实具有抗肿瘤活性的来源有: 大肠杆菌( E．coli) 、菊欧文氏菌、嗜热古生菌、假单胞杆菌、假丝酵母菌、枝孢霉菌、胡萝卜软腐果胶杆菌和地衣芽孢杆菌等。市场上常用E．coli来源的L－天冬酰胺酶Ⅱ，而在L-Asp药物的临床使用中，存在药物的半衰期短及多种副作用如过敏反应、免疫抑制、胰腺炎、肝炎、神经毒性、凝血障碍，以及因抗原性导致产生抗体而治疗失败等等诸多问题，从降低抗原性为目的出发，我们将采用来源于解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens C06的L-AspⅡ，对其进行分子设计改造，以降低其免疫原性，得到更为优质的L－天冬酰胺酶。
1.2 定向进化技术对酶进行改造
近年来对于生物酶应用需求的提高，涌现了一系列蛋白质定向进化技术如饱和突变、易错 PCR（epPCR）和DNAshuffling等，。通过在实验室条件下模拟自然进化过程，从构建的突变体文库中筛选到能满足特定需求的目标突变体，大大提高了酶的可用性。根据突变体文库构建方法的不同，定向进化可分为非理性设计、半理性设计和理性设计3种策略。目前国内外关于L-天冬酰胺酶分子改造方面的研究主要集中于理性设计,张显[1]等通过定点突变改变了枯草芽孢杆菌L-天冬酰胺酶氨基酸G107D，定点突变后的突变酶，催化活力和热稳定性均得到提高,而有关L-天冬酰胺酶的定向进化研究报道甚少。非理性设计即随机进化策略，具有不需要对酶序列及结构有深入了解，仅通过简单随机突变和片段重组的方法模拟自然进化，即可得到一系列的具有不同性质上改变的突变体酶，再根据我们需要目标酶的各项特性，我们可以从得到的突变体酶中筛选出我们所需的目标酶。
DNA改组技术（DNAshuffling）是将一组家族基因(同源性gt;70％)或来自同一基因的具有不同突变位点的突变体DNA用DNase工或限制性内切酶切割，并回收小片段。由于这些小片段具有一定的同源性，故可以进行无引物的有性PCR，从而实现同源基因的重组。获得的随机重组突变体再加入目的基因两端引物进行PCR，扩增全长基因，如此重复循环进行，直至获得理想的突变体。epPCR是基于大幅增加DNA Taq聚合酶总体错配频率的一种常用定向进化方法。该法主要是利用DNA聚合酶缺乏3rsquo;一5rsquo;外切酶活性，且在标准条件下，具有较高的错配率从而获得突变体，这种方法主要是通过改变PCR的一些条件来增加错配率。这些条件包括有：①添加Mn2 来降低碱基配对的特异性；②不平衡的dNTP浓度以便达到错误掺人的目的；③增加M92 浓度使退火过程中没有互补的碱基对；④增加聚合酶浓度以便提高延伸过程中错配的几率。易错PCR之后，将产物克隆到相应的质粒里构建突变基因文库。epPCR还可与饱和突变技术、DNA shuffling等技术组合使用，迅速积累有义突变，得到最佳突变组合的酶基因。
1.3 酶定向进化技术的筛选方法
1.3.1 涂布平板法 主要利用底物与酶的特殊荧光或颜色反应，来鉴定酶是否具有预期与底物的反应活性，以此来筛选鉴定目的突变酶，该方法操作简便并且能够很好地鉴定理想突变体，但只能对酶的催化性质进行辨别，不能对酶进行活性高低的筛选。
1.3.2 表面展示技术 表面展示技术是在定向进化研究中应用比较广泛的一种高通量的筛选方法，常用的有细胞表面展示技术、噬菌体表面展示技术、核糖体展示技术及mRNA展示技术等。这些表面展示技术实现了物质基因型和表现型之间的连接，具有库容量大、高通量、筛选简便等优点。
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