研究背景
乳腺癌是全球发病率排第二位的恶性肿瘤（11.9％），仅次于肺癌（13.0％），也是女性最常见的恶性肿瘤，《全球癌症报告2014》中数据显示，2012年全球女性乳腺癌新发病例数超过167.7万，占女性新发癌症病例的25.2％，其中中国新发病例数18.7万人，占女性乳腺癌新发病的11.2％。手术治疗、化疗、放疗、内分泌治疗等是针对乳腺癌主要的治疗手段，但治疗的副作用会持续数月至数年，影响乳腺癌病人的长期健康情况。随着分子生物学、蛋白质组学和药理学的不断发展，机体内诸多关于蛋白调控网络逐渐被报道，并在肿瘤的发生、发展、侵袭及转移扮演着重要的作用。p53作为“管家基因”，可以通过与多种蛋白(MDM2、Snail)形成复合物，调控下游通路的转录水平。由于 p53 在肿瘤发生发展中的重要作用，大量的研究集中在 p53 在蛋白相互作用网络的调控机制和作用, 揭示肿瘤发生和发展的分子机制。 MDM2 是 p53 稳定性和活性的关键调节因子，阻断其对 p53 的结合可以逃离负反馈控制并引起 p53 的聚集和激活, 在 p53激活剂的研究中最为广泛。如 Nutlin 通过其结合于 MDM2 蛋白和 p53 蛋白作用位点从而抑制两者的相互作用，可以有效提高 p53 的活性。 该类抑制剂在体内活性欠佳，临床进展缓慢。因此，针对p53 信号通路的药物研发中, 需要拓展新的思路, 寻找新的作用机制的 p53激活剂，以提高目前基于p53/MDM2 靶点所开发的化合物活性不足的缺陷。
研究目的
SN004对抗p53野生型肿瘤细胞的影响以及作用机制
研究内容
分别选择p53野生型和p53突变型细胞，用CCK8去测试各类细胞在24小时和48小时的生存率，分别检测药物对野生型p53和突变型p53的影响。
研究方案：1)细胞增殖： CCK8 检测 SN004 对相关肿瘤细胞的细胞活力的影响。
2)细胞周期： PI 单染(流式细胞术)检测 SN004 对 HCT-116 细胞的周期阻滞作用。
3)细胞凋亡： Annexin V /PI (流式细胞术)检测 SN004 对 HCT-116 的细胞凋亡情况。
研究方法
1)实时荧光定量 PCR 和 Western blot 方法检测 SN004 作用后，相关细胞内 Snail/p53 信号轴的基因和蛋白表达水平的影响。
2)蛋白合成研究: 常规培养细胞, 先添加 SN004 处理细胞不同时间, 接着使用放线菌酮(CHX)结束细胞内蛋白合成, 然后用含有 RNase 的裂解液回收细胞蔗糖密度梯度离心法收集多聚核糖体，分离 mRNA 并反转录，然后进行 qPCR 检测 p53 表达 。
3)蛋白降解研究: 常规培养细胞，添加放线菌酮(CHX)，追踪 SN004 如何影响 p53 蛋白稳定性; 添加蛋白酶体抑制剂(如 MG132)和溶酶体抑制剂(如Chloroquine)，与 SN004 共同处z理细胞常规提取蛋白,Western blot 检测是否能够恢复 p53 蛋白表达。
预期成果
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