基于native MS的拟南芥AL蛋白PHD结构域对组蛋白甲基化识别特性的研究文献综述

 2022-12-24 13:36:07

开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）

一、研究背景及文献综述

组蛋白是染色质的重要组成部分，具有H1、H2A、H2B、H3和H4五种类型，除H1外，其余 4 种组蛋白都是N端富含碱性氨基酸，C端富含疏水氨基酸。在核心组蛋白中，组蛋白N末端存在于八聚体的外侧，能够与其他调节蛋白和DNA发生作用，故其N末端氨基酸的翻译后修饰(如甲基化、乙酰化、磷酸化等)对于调节染色质的结构和功能，控制基因转录的激活与抑制以及调控基因表达具有关键作用[1, 2]。其中，组蛋白甲基化主要发生在赖氨酸和精氨酸的侧链上，赖氨酸可以发生单甲基化（Kme1），二甲基化（Kme2）和三甲基化（Kme3），精氨酸可以发生单甲基化（Rme1），对称二甲基化（Rme2s）和不对称二甲基化（Rme2a）。组蛋白甲基化受多种酶的调控，包括催化甲基从S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosyl methionine，SAM）转移至赖氨酸或精氨酸侧链的甲基转移酶，和催化去甲基化的脱甲基酶[3]。

组蛋白翻译后修饰可以被组蛋白结合蛋白识别，目前已有许多蛋白被证明可以识别组蛋白的PTMs。PHD结构域是具有约60个氨基酸残基的结构域，以典型的“CCCC-HCCC”基序螯合两个锌离子[4]，有研究表明，PHD结构域可以作为组蛋白H3修饰的识别蛋白，主要可分为识别组蛋白H3K4me3/2、识别未修饰的组蛋白H3K4和识别组蛋白H3K14ac三类，其中识别H3K4me3是PHD结构域最突出的功能[5-8]。AL（Alfin1-like）蛋白是具有约250个氨基酸残基的蛋白质，含有两个结构域：N端的PAL结构域和C端的PHD结构域。AL蛋白以其在苜蓿中的同源蛋白Alfin1命名，Alfin1蛋白与耐盐性相关。拟南芥基因组共编码七种AL蛋白，AL1-AL7，已有研究表明AL蛋白的PHD结构域能够与第四位赖氨酸三甲基化的组蛋白H3（H3K4me3）结合，但对其结合特性还缺乏深入研究[9-11]。

在过去的十年中，自上而下（Top-down，TD）的质谱策略和非变性质谱（Native MS）随着离子化方式、离子活化方式和碎裂方式的不断发展而逐渐完善，与传统的基于肽段水平的检测相比，自上而下的质谱策略可以保留分析对象的原始信息，避免前处理过程中额外引入或丢失某些翻译后修饰，但更加要求仪器的分辨率的数据解析过程，主要应用于蛋白质组学中蛋白质异质体（Proteoform）的检测。非变性质谱允许分析物在具有空间结构以及结合配体或多聚的状态下直接碎裂或标记以获得结构信息，使用非变性自上而下质谱联合多种离子碎裂方式以及交联反应、氢氘交换等质谱技术可共同探测蛋白-配体结合后的位点特征及结构变化，为阐明蛋白-配体作用机制提供研究基础[12-14]。

常用于蛋白质组学研究的离子碎裂方式[15, 16]包括基于碰撞活化的解离方式：碰撞诱导解离（CID）、高能碰撞活化解离（HCD），大多数碰撞活化方法的高效率是一个巨大的优势，使其成为许多蛋白质组学应用的首选，且CID是所有串联质谱仪的常规碎裂方法，该方式断裂骨架肽键，形成b/y型离子。离子阱仪器中常规低能CID的一个缺点是低质量截止（LMCO），即质荷比范围较低，高能碰撞活化解离（HCD）的发展大大缓解了这一局限，是现在大多数商业离子阱平台支持的功能，因其活化过程与捕获参数无关，所以较低的质量范围不会被截断，但基于碰撞的碎裂方式可能导致PTM的损失。基于电子的解离方式：电子捕获解离（ECD）、电子转移解离（ETD）、电子诱导离解（EID）等，在过去的十年中已广泛用于肽和蛋白质的分析，工作原理基于带正电荷的分析物离子与低能电子的相互作用，主要作用位点为赖氨酸、精氨酸、组氨酸及N端氨基，断裂主链N-Calpha;键并产生c/z型离子。基于电子的方法不会引起翻译后修饰的损失，可用于定位修饰位点，但该类方法显示出对前体离子电荷状态的显著依赖性，不适用于单质子化的前体，低电荷状态离子的离子倾向于发生电荷减少而不是解离，产生很少的碎片离子，特别是对于双电荷肽离子。现在通常采用几种增强自由基迁移率并破坏分子内相互作用的方法，包括在ECD/ETD过程之前或过程中使用低水平碰撞活化或红外光活化，这种额外添加的内部能量可有效破坏肽或蛋白质的二级和三级结构，引起自由基离子的加热并增强碎片离子之间的分离；基于光子的活化解离方式：红外多光子解离（IRMPD）、紫外线光解离（UVPD）等，气相离子吸收光子会导致通电而碎裂，因此称为光解离，红外多光子解离的活化过程类似于低能CID的热加热过程，断裂最不稳定的肽键，而紫外线光解离使用能量更高的紫外线光子来活化和离解离子，可形成含a/x型离子在内的多种碎片离子类型；其他活化方法：如表面诱导解离（SID）等。

二、研究内容

本课题将使用非变性质谱技术和自上而下的质谱研究策略，对拟南芥AL1和AL2蛋白与H3K4me3和未甲基化的H3K4（H3K4me0）的结合位点和结合能力差异进行分析，为AL蛋白作为组蛋白甲基化的识别蛋白发挥调控功能提供研究基础。

三、研究方案

在高分辨质谱仪、nano-ESI离子源及正离子模式下采集拟南芥AL1、AL2蛋白，及两蛋白分别与未甲基化和三甲基化的H3K4结合后的native MS图谱，确定其结合比例，结合前后质量及蛋白可能发生的结构变化；采用ETD、HCD、UVPD等裂解方式获取完整蛋白/蛋白复合物的串联质谱信息，对比原蛋白序列解析碎片离子归属，并推测碎片产生原因及携带的结构信息；使用Xcalibur、Masslynx等质谱应用软件对采集到的数据进行整理与解析。

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