- 拟解决的问题
注射用脑蛋白水解物（II）是猪脑蛋白经酶水解而产生的富含多种氨基酸和小分子生物活性多肽的混合物，作用于神经系统，促进神经元的存活，具有神经营养和神经保护的作用。已在临床上使用注射用脑蛋白水解物（II）治疗缺血性脑血管病，可显著改善神经功能，促进神经元的分化，保护神经元免受缺血和神经毒素的影响。随着对注射用脑蛋白水解物(II)的不断研究，临床逐渐使用注射用脑蛋白水解物（II）治疗阿尔兹海默症、急性脑出血、缺血性脑卒中等神经系统性疾病，但是，尚不清楚注射用脑蛋白水解物（II）改善神经功能的作用是否与轴突再生有关，缺乏对注射用脑蛋白水解物(II)的作用机制的探究。因此，在本课题中，我们将研究注射用脑蛋白水解物（II）对神经元细胞轴突再生的作用，并阐述注射用脑蛋白水解物（II）促进神经细胞轴突再生的可能分子机制，研究结果将为进一步提高注射用脑蛋白水解物（II）药物临床应用价值提供理论指导。
- 采用的研究手段
为研究注射用脑蛋白水解物（II）对神经元细胞轴突再生的影响及其潜在的分子机制，采用免疫荧光染色检测小鼠脑神经瘤细胞(Neuro-2a)和小鼠原代皮层神经元细胞的轴突长度;通过蛋白免疫印迹法检测Neuro-2a细胞和小鼠原代皮层神经元细胞内磷酸化TrkB蛋白的表达水平;
1 细胞培养
将Neuro-2a细胞从液氮库拿出，在37℃的水中迅速摇晃使其融化，然后1000转离心5min。离心后重悬细胞沉淀在含有10% FBS的MEM培养基，37℃、5% CO2的细胞孵箱中培养，每隔24 h换液，约3天长满。待长满后，用新鲜的培养基洗涤除去细胞碎片和贴壁不牢状态不好的细胞，然后用枪头吹落剩下的细胞，离心后1:2传代。
2 细胞免疫荧光实验
将Neuro-2a细胞点在PLL过夜预先包被过24孔板里。上下左右摇匀细胞悬液后，放在细胞孵箱中培养过夜。第二天后，观察到Neuro-2a细胞形状为圆形，无触角，方可进行下一步实验。将培养基换成含有0.1% FBS的MEM培养基，并加入不同浓度（1mu;g/ml、5mu;g/ml）的CBL，对照孔加入相应体积的生理盐水，分别24h、48h、72h收集细胞进行细胞免疫荧光实验。待实验结束，取出培养板，吸掉培养液，用无菌级PBS洗涤3次，4%的多聚甲醛固定30min，PBS洗涤3次，每次3min。然后用8%山羊血清封闭60min。封闭结束后，不洗涤，直接用鼠抗TUBB3（1:200）在4℃冰箱内孵育过夜。约12h后，回收一抗，PBS洗次，每5min。加入Alexa Fluor goat anti-Mouse IgG（H L）二抗以1:500的比例严格避光孵育1h，弃去抗体。然后PBS洗涤3次，每次5 min，最后在24孔培养板中加100ml的Hoechst3334染液，在高内涵成像显微镜下拍摄图片。每组拍摄4-6张图片，并使ImageJ软件测量细胞轴突的长度。
3 蛋白免疫印迹（Western Blot）实验
（1）用蒸馏水仔细冲洗玻璃板，倒置放在烘箱中烘干，然后60℃烘干后冷却至常温，用夹胶框夹紧；
（2）配制12%SDS-PAGE分离胶：依次加入三蒸水4.1ml，以慢速加入3.3ml30%丙烯酰胺（丙烯酰胺容易倒吸）、2.5 ml 的Tris·HCl（pH8.8）（作用为分离不同分子量的蛋白）、100mu;l 10%SDS（维持蛋白质的变性状态）、100mu;l的10%APS（促使分离胶凝结）、10mu;lTEMED（具有神经毒性，作用为催化分离胶的凝结），充分混匀后，用移液枪将分离胶加入夹好的玻璃板中到适宜的高度，再加三蒸水或者乙醇液封，压平分离胶并消除分离胶的泡。室温约15min，分离胶凝结，倒出三蒸水或者乙醇，用纸从一侧吸干；
（3）配制4%SDS-PAGE浓缩胶：依次加入2.1ml的三蒸水、慢速加入0.5 ml的30%丙烯酰胺、0.38 ml的Tris·HCl、30mu;l的10%SDS、30mu;l的10% APS、5mu;l的TEMED，充分混匀后，迅速用枪加在分离胶上面，并将电泳梳从一侧放入，避免产生气泡；
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