新型NO供体型川芎嗪衍生物的设计与合成文献综述

 2023-01-29 08:01
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开题报告内容：

一、研究背景

恶性肿瘤严重威胁人类的健康和生命安全1。美国癌症协会报道，2007年全世界有1200万例新增癌症病例以及760万例癌症死亡病例2。第五届亚太癌症预防组织大会发布的《2010年癌症报告》指出，今后20年世界癌症患者人数将呈快速上升趋势。报告预测，从2008年至2030年，全球新增癌症患者人数将从每年的1240万增至2640万。自上世纪70年代以来，我国肿瘤死亡率同样呈持续增长趋势，平均每年约160 万人死于癌症，主要为肺癌、肝癌和胃癌。

随着现代医学诊断方法和各种治疗手段、技术（手术、放化疗、激素治疗等）的不断发展，早期肿瘤的治愈率已有显著的提高。但是对于中晚期恶性肿瘤尤其是已经发生了浸润、转移的晚期肿瘤，化疗仍然是肿瘤治疗的主要手段。不幸的是，肿瘤细胞多药耐药（Multidrug resistance, MDR）的产生，极大地降低了化疗的成功率。美国癌症协会研究表明，90％以上肿瘤患者的死亡与机体对化疗药物产生的MDR 密切相关3。寻找克服肿瘤MDR的新方法及新型的化疗药物成为目前肿瘤化疗治疗领域的研究热点之一。

1. 肿瘤多药耐药的产生机制及克服策略

肿瘤多药耐药 MDR系指肿瘤细胞对一种抗肿瘤药物产生耐药性的同时，对其它化学结构和作用机制完全不同的抗肿瘤药物所产生的交叉耐药现象。肿瘤MDR 包括内在性多药耐药（Intrinsic multidrug resistance）和获得性多药耐药（Acquired multidrug resistance），是目前导致肿瘤化疗治疗失败的重要原因4。

1.1 肿瘤MDR的产生机制

肿瘤MDR的产生机制复杂，有关MDR形成的机制研究近年来已成为国内外学者研究的热点。目前认为，肿瘤MDR产生机制主要有以下几种：ABC转运蛋白介导的MDR; 酶系统介导的MDR; 凋亡调控基因介导的MDR; DNA修复上调介导的MDR。

1.2 肿瘤MDR的克服策略

针对肿瘤MDR，国内外学者尝试了多种克服策略（Figure 1）5，主要包括：1）开发与耐药相关的ABC转运蛋白抑制剂，将其与抗肿瘤药物联合使用，通过发挥ABC转运蛋白抑制剂抑制转运蛋白的功能或/和表达的活性，增强耐药肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，杀伤耐药肿瘤细胞；2）开发具有抗耐药肿瘤活性的化合物，采用单一用药的方式，发挥化合物自身的抗肿瘤活性，直接杀伤耐药肿瘤细胞；3）其它策略，如利用生物学、药剂学及材料学等方法，提高现有化疗药物在肿瘤细胞内的聚集或抗肿瘤活性，进而克服肿瘤MDR。

Figure 1 Strategies to overcome MDR

迄今为止，还没有P-gp抑制剂药物上市6,7，其瓶颈所在：1）抑制剂对P-gp的选择性差；2）抑制剂对P-gp抑制活性低；3）抑制剂自身的毒性；4）抑制剂影响抗癌药物药代动力学性质，增加了药物的毒副作用等。此外，P-gp在正常组织中同样表达，主要分布在肠上皮细胞、肾近曲小管细胞、肝胆管细胞膜，以及血脑、血睾和胎盘的上皮细胞8,9，并通过外流泵参与分泌外源性物质和毒性代谢物的过程10,11。当P-gp的正常功能被抑制后，抗癌药在体内的代谢和排泄受到影响，血药浓度水平提高，增加了其对正常组织的毒性12。

P-gp抑制剂研发面临的这些困难和挑战，以及前三代P-gp抑制剂在临床上的失败，重创了药物开发公司及科研人员在该领域的研究信心，如何解决上述问题，成为P-gp抑制剂研发道路上的拦路虎。

幸运的是，在扩大P-gp抑制剂的筛选范围后，人们发现作为药物先导物的化合物库-天然产物在抑制P-gp活性方面表现出了特有的优势，给抑制剂的开发带来了新的希望和契机。从天然产物中寻找高效、低毒、高选择性抑制剂成为了P-gp抑制剂研发的新方向和重点13：1.天然产物本身就源自可食用性的植物，作为日常食品，其毒副作用小，甚至不存在毒副作用；2、许多天然产物的粗提物或是单一组分不仅能逆转MDR活性，同时不影响抗癌药物的药代动力学性质；3、一些天然产物在抑制P-gp的功能的同时，还能抑制其表达；4、有些天然产物既能逆转MDR，同时具有抗肿瘤活性，在治疗耐药肿瘤时，可发挥一箭双雕的作用。上述优势恰恰能够克服前三代P-gp抑制剂开发所面临的瓶颈问题，使天然产物研究成为目前P-gp抑制剂研究领域的主战场。近年来中药川芎嗪在抗肿瘤及抑制P-gp活性方面表现出良好的应用前景，引起了我们课题组的关注。

2. 川芎逆转MDR研究

近年来中药有效、低毒，在逆转肿瘤多药耐药性方面已取得进展。从事中药逆转MDR的课题具有重要的理论与实用价值。川芎嗪是从川芎中提取一种生物碱单体:4-甲基吡嗪(tertramethylpyrazine TMP)，为一种新型的钙离子拮抗剂，具有抑制自由基产生、提高内源性超氧化物歧化酶 (SOD)活性、清除氧自由基、改善血液流变学、抑制血小板聚集、抑制纤维化、调节脂质代谢、抗脂质过氧化作用等药理活性。由于它还具有钙通道阻滞活性，因此常被作为多药耐药肿瘤的逆转剂14。

除了自身抗癌作用，低浓度的川芎嗪对多种化疗药物也有增敏作用，可增强后者杀伤肿瘤细胞作用。与化疗药物合用可提高多药耐药细胞内化疗药物的浓度，从而增加化疗药物对肿瘤的毒性作用。达到一定浓度的川芎嗪可以下调mdrl mRNA的表达，使细胞膜表面的P-gpl70表达减弱，拮抗其介导的肿瘤多药耐药，从而达到部分逆转细胞多药耐药的作用。

3. NO供体抗肿瘤MDR活性

研究表明，NO及NO供体通过调节NF-kappa;B相关通路（Figure 2），在恢复耐药肿瘤对化疗、免疫治疗、放疗的敏感性及其抑制肿瘤转移中发挥至关重要的作用15。从Figure 2 我们可以清晰的看出：1）NF-kappa;B能够诱导转录因子Snail，Snail通过抑制上皮钙粘蛋白、诱导上皮细胞间质转型，导致肿瘤细胞的转移；2）Snail抑制raf 激酶抑制蛋白的表达，导致肿瘤细胞的转移；3）NF-kappa;B能够诱导YY1（FAS 和DR5 的转录抑制因子），激活YY1后，进而抑制FAS和DR5，导致机体免疫耐受，降低了机体对肿瘤的抵抗能力；4）NF-kappa;B 激活抗凋亡基因（Bcl-2、Bcl-xL、XIAP 和cIAPs 等），导致肿瘤细胞对化疗药产生抗凋亡耐药。而NO及NO供体可以抑制持续活化的NF-kappa;B，抑制NF-kappa;B介导的下游信号通路中的各种抗凋亡基因产物，可恢复耐药肿瘤对化疗、免疫治疗、放疗的敏感性，并抑制肿瘤转移。

Figure 2 Role of NO donors in mediating the inhibition of survival pathways in tumor cell resistance and metastasis

恶性实体瘤肿瘤组织普遍存缺氧状态，肿瘤为了自身的生存，在此状态下作出自我调整，使得HIF-1alpha;在肿瘤细胞中高度表达及活化，激活下游信号通路等，导致癌症化疗、放疗或免疫疗法的耐药以及预后不良。因此，以HIF-1alpha;为靶点的抗癌药物研究被认为是一种新的癌症治疗策略16。研究表明，NO供体与化疗药物联用，通过形成过氧化亚硝酸盐损伤肿瘤DNA并激活p53，减少HIF-1alpha;在缺氧癌细胞中的聚集，可克服对常规治疗剂的耐药性。在一个II期临床试验中，NO供体硝酸甘油和长春瑞滨/顺铂联合治疗III 或IV 期非小细胞肺癌病人，与单用长春瑞滨或顺铂相比，治疗效果提高了72% 17。2001 年Matthews小组采用低剂量的硝酸甘油（GTN）和DETA/NO（Figure 3）可逆转缺氧介导的人乳腺癌细胞和小鼠黑色素瘤细胞的耐药性18。2007年Frederiksen等人发现硝酸甘油和硝酸异山梨酯可以通过cGMP依赖的信号途径逆转缺氧介导的MDR，恢复人前列腺癌细胞和乳腺癌细胞对阿霉素和紫杉醇的敏感性19。此外，NO供体作为放疗和免疫疗法的增敏剂也取得了很好的疗效。

NO供体型化合物除了对凋亡通路介导的MDR具有逆转作用外，还可以通过抑制ABC转运蛋白的功能或表达，克服其介导的MDR。Riganti小组研究发现，使用NO生成诱导剂（阿伐他汀）及NO供体S-亚硝基-N-乙酰青霉胺（SNAP，Figure 3）能够逆转人结肠癌耐药株细胞HT29-dx（P-gp和MRP蛋白过度表达）对阿霉素的耐药性，其机制与NO介导耐药蛋白的酪氨酸硝基化有关20。Fruttero等人21研究发现，作为具有抗肿瘤活性的呋咱氮氧化物类NO供体型化合物可以恢复高表达P-gp和MRP的耐药肿瘤细胞（MDCK）对阿霉素的敏感性，克服P-gp和MRP1介导的MDR，其中3-苯磺酰基取代的呋咱氮氧化物（3-BF）对P-gp的抑制活性最好（Figure 3）。深入研究发现，该类化合物通过硝化耐药转运蛋白，抑制P-gp的功能，逆转其介导的肿瘤MDR。

Figure 3 NO donors with MDR reversal effect

NO供体型药物Saq-NO具有较好的抗肿瘤活性，可显著抑制B16黑色素瘤在C57BL/6小鼠体内增殖，且毒副作用明显低于沙奎那韦22。2010年Rothweiler等报道，Saq-NO能够逆转高表达P-gp的耐药细胞UKF-NB-3MDR1对化疗药长春新碱的耐药性（逆转作用是沙奎那韦的30倍），其逆转机制与Saq-NO抑制P-gp的功能相关。随后，又使用高表达P-gp的耐药细胞UKF-NB-3MDR1和UKF-NB-3rVCR10，检测Saq-NO抑制P-gp介导的底物（Rh123）外排能力，发现Saq-NO抑制Rh 123外排的IC50 值分别为0.70 0.14 mu;M 和0.053 0.021 mu;M，而沙奎那韦为9.39 2.81 mu;M 和2.45 0.33 mu;M。结果表明，经NO供体修饰后，化合物的P-gp 抑制作用显著提高。

前已述及，克服P-gp介导的MDR的策略之一是开发新型的抗肿瘤药物（逃避耐药）。但带来的问题是，这种新型抗肿瘤药物随着化疗周期的延长，肿瘤细胞会对其产生获得性耐药。因此，如何制备不易产生耐药的新型抗肿瘤药物是上述策略成功的关键。作为新型的抗肿瘤药物，NO供体型化合物会不会产生获得性耐药呢？Hutchens 等人16对NO供体型抗肿瘤化合物的获得性耐药进行了系统的研究。他们将人早幼粒细胞白血病细胞株（HL60细胞）暴露到NO供体型抗肿瘤化合物PABA/NO的环境中，并逐渐提高PABA/NO的浓度，最终获得了耐药的肿瘤细胞株HL60。但研究发现，该耐药株耐药倍数非常低，即使长时间诱导（6-8 个月），细胞株对药物也只有2-4倍的耐药（耐药株中IC50~15 mu;M vs. 敏感株中IC50~8 mu;M）。值得注意的是，当去除细胞培养介质中的PABA后，耐药株在培养数代后会恢复对药物的敏感性，说明NO供体型化合物诱导产生的耐药不是遗传学稳定的。作用机制研究表明，PABA诱导的耐药是由于GST-pi;水平的降低，NO释放减少，细胞对亚硝化应激产生了改变所导致的。实践表明，这种耐药不易获得，即使短暂耐药也是遗传学上不稳定的。

时至今日，肿瘤的复发及耐药还没有理想的应对策略。但已有的研究表明，NO及NO供体通过多种机制，如：扩张血管从而提高血流量和肿瘤内的供氧；抗氧化作用；下调谷胱甘肽的解毒能力和氧化还原缓冲系统；抑制重要的转录因子包括NF-kappa;B和HIF-1alpha;；抑制药物外排转运体P-gp及DNA修复酶等，可有效克服肿瘤MDR16。这些重要发现再加上NO供体本身不易产生耐药的优势，使得人们相信， NO供体型化合物可能在抗肿瘤及MDR领域具有潜在的应用前景23,24。

二、 研究方法及方案

川芎嗪在逆转肿瘤细胞多药耐药性方面，因其安全、有效；对正常组织毒性小；在体内能达到有效浓度；本身具有一定的抗肿瘤活性；分子半衰期较长，因此在肿瘤细胞多药耐药方面具有其独特的优势。

NO及NO供体通过多种机制，如：扩张血管从而提高血流量和肿瘤内的供氧；抗氧化作用；下调谷胱甘肽的解毒能力和氧化还原缓冲系统；抑制重要的转录因子包括NF-kappa;B和HIF-1alpha;；抑制药物外排转运体P-gp及DNA修复酶等，可有效克服肿瘤MDR。

这些重要发现再加上NO供体本身不易产生耐药的优势，使得人们相信，NO供体型川芎嗪可能在抗肿瘤及MDR领域具有潜在的应用前景。本项目以川芎嗪活性代谢物羟甲基川芎嗪HTMP为先导物，运用不同类型的连接基团将其与NO供体相偶联，设计、合成NO供体型川芎嗪衍生物，并探究其抗P-gp介导的肿瘤MDR活性。

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