GL-V9抑制DSS诱导的急性结肠炎文献综述

课题性质

基础研究 radic; 应用课题 设计型 调研综述 理论研究

开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）

课题来源：自拟课题

课题依据：

汉黄芩素是一种来源于黄芩系唇形科植物黄芩的干燥根的黄酮类化合物，实验研究表明汉黄芩素具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤的生物活性。GL-V9是汉黄芩素的衍生物，已有报道GL-V9具有抗肿瘤作用，而在炎症的研究中未见报道。

炎症性肠病（inflammatory bowel disease, IBD）是由免疫反应失调所致的以持续肠道炎症为特征的一类疾病，包括克罗恩病（CD）和溃疡性结肠炎（UC）^[1]。IBD 的发病机制尚存争议，越来越多的实验证明慢性肠炎可能由免疫系统功能紊乱造成。活性氧（reactive oxygen species,ROS）与IBD的氧化损伤有一定联系，AMP-活化蛋白激酶（AMPK）和硫氧化还原蛋白-1（Thioredoxin-1，Trx-1）都具有能有效降低细胞内ROS水平的作用^[2]，GL-V9能够抑制DSS诱导的结肠炎，其机制可能与激活AMPK通道和上调Trx-1有关。 由此可知GL-V9可能是潜在有效治疗结肠炎的药物。

在本实验中，初步评价GL-V9抑制DSS诱导小鼠结肠炎的药效研究并探讨其作用机制，之后又在体外模型RAW264.7细胞株中研究GL-V9的抗炎作用，通过ELISA和Western Blot蛋白分析，探讨GL-V9抑制LPS刺激下细胞因子的分泌的作用机制。

主要解决的问题：

1. GL-V9防止DSS诱导的小鼠结肠炎发生的药效学研究

1.1急性结肠炎小鼠模型建立

配5% DSS溶液，让小鼠自由饮用7天，而后饮用3天正常水，建立小鼠急性结肠炎模型；空白对照组10天均饮用正常水。

1.2急性结肠炎小鼠给予药物干预

建立模型的同时，给予药物干预（每天灌胃一次），给药组分别为GL-V9（12.5mg/kg、25mg/kg和50mg/kg）以及阳性药对照5-ASA（50mg/kg）。

1.3 GL-V9防止DSS诱导的小鼠结肠炎药效学研究

1.3.1体重变化

10天后处死小鼠时，对小鼠称重，记录体重数据

1.3.2肠子长度变化

10天后处死小鼠，剥离剪下肠子，量取肠子长度，记录数据

1.3.3肠组织HE染色

本实验用的是组织的石蜡切片。首先先在烘箱中放置1小时以上，直至切片的石蜡呈水滴状。接着放入二甲苯中15min，并重复放置另一个二甲苯中一次，然后放置在100%乙醇5min，95%乙醇5min，80%乙醇5min，70%乙醇5min，蒸馏水5min。把水浸干后，苏木精液染色5min，用小水流洗去苏木精液，蒸馏水过洗 1-2秒。再用0.5%伊红液染色3min作用，蒸馏水稍洗1-2秒。接下来进行脱水透明，先用80%乙醇稍洗2秒，95%乙醇3秒，重复放置乙醇中3秒，无水乙醇5-10min，二甲苯5-10min，再放置二甲苯中2min，重复放置二甲苯中2min，中性树胶封固，显微镜下观察。

1.3.4 ELISA检测血清和肠组织匀浆中细胞因子浓度

1）加样品和标准品（100 mu;L），37℃反应 90 分钟。不洗。

2）加生物素标记抗体（100 mu;L），37℃反应 60 分钟。0.01M TBS 洗涤 3 次。

3）加 ABC（100 mu;L），37℃反应 30 分钟。0.01M TBS 洗涤 5 次。

4）TMB（90 mu;L）37℃反应 20-25 分钟。

5）加入TMB（100 mu;L）终止液，450nm检测各组吸光度（OD值）。

1. GL-V9抑制LPS刺激下RAW264.7细胞中细胞因子分泌的药效学研究

2.1体外细胞培养

将RAW264.7细胞按适当浓度接种于培养瓶中，加入含100 U/mL的青霉素、100 U/mL的链霉素、10%胎牛血清的DMEM培养液，置于37℃恒温、5%CO2及饱和湿度的培养箱中培养，细胞呈悬浮生长。每2～3天传代一次，传代时吹打均匀，根据所需细胞量平均分配移入新培养瓶中，适量添加完全培养液。

2.2 ELISA检测GL-V9对LPS刺激下RAW264.7细胞中细胞因子的分泌

设置实验组别，空白对照组（未给予LPS刺激）、LPS组（1 mu;g/ml）、LPS GL-V9（2.5,5,10 mu;M）组，作用12h之后收集各组别细胞（细胞上清用于ELISA检测）。

1）加样品和标准品（100 mu;L），37℃反应 90 分钟。不洗。

2）加生物素标记抗体（100 mu;L），37℃反应 60 分钟。0.01M TBS 洗涤 3 次。

3）加 ABC（100 mu;L），37℃反应 30 分钟。0.01M TBS 洗涤 5 次。

4）TMB（90 mu;L）37℃反应 20-25 分钟。

5）加入 TMB（100 mu;L）终止液，450nm检测各组吸光度（OD值）。

1. GL-V9抑制LPS刺激下RAW264.7细胞中细胞因子分泌的作用机制研究

3.1 总蛋白的提取

1）收细胞：2000 rpm离心收集细胞。

2）提蛋白：用冷PBS洗两次，尽量弃去残余的PBS。用适量体积冷细胞裂解液（临用前加入各蛋白酶抑制剂及DTT）重悬细胞，冰上放置40 min，充分裂解细胞。

3）将细胞裂解液4°C、12000 rpm 离心30 min，上清液为抽取的总蛋白。用BCA法测定蛋白含量，并稀释成相同的浓度。然后将同等总蛋白量的不同处理样品按1:3与4times;loading buffer混匀，沸水浴变性10 min后，于-20°C保存。

3.2 核蛋白和胞浆蛋白的提取

本实验通过凯基核蛋白和胞浆蛋白提取试剂盒（KeyGEN Nuclear and Cytoplasmic Protein Extraction kit），制备纯度较高的核蛋白和胞浆蛋白。提取出的蛋白可用于进一步的Western Blots等后续蛋白质研究。

1）收细胞：2000 rpm离心收集细胞。

2） 加入预冷的Buffer A（每987 mu;l Buffer A中加入10 mu;l PMSF，1 mu;l Leu，1 mu;l DTT，1 mu;l NaF），剧烈振荡15秒（即最大转速涡旋），置冰上10-15分钟。每个样品中加入11 mu;l预冷的Buffer B，剧烈振荡15秒（即最大转速涡旋），置冰上10-15分钟。剧烈振荡15秒（即最大转速涡旋），用冷冻高速离心机以16000 rpm 4 °C离心5分钟，尽快将上清转如预冷的离心管中，置冰上，即为胞浆蛋白。

3）为了进一步清除胞浆蛋白，重复上面Buffer A和Buffer B的步骤。根据细胞压积，在离心管底部的沉淀物中加入预冷的Buffer C（每987 mu;l Buffer C中加入10 mu;l PMSF，1 mu;l Leu，1 mu;l DTT，1 mu;l NaF），剧烈振荡15秒（即最大转速涡旋），置冰上40分钟，每间隔10分钟就要剧烈振荡15秒（即最大转速涡旋），用冷冻高速离心机以16000 rpm 4 °C离心10分钟，尽快将上清转如预冷的离心管中，置冰上，即为核蛋白。提取的胞浆蛋白和核蛋白用BCA法进行蛋白定量。然后将同等总蛋白量的不同处理样品按1:3与4times;loading buffer混匀，沸水浴变性10 min后，于-20°C保存。

3.3 Western Blot蛋白分析

1）制胶和电泳：制备10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，60 V浓缩胶，120 V分离胶，2.5～3 h；

2）转膜：电泳后取下胶，按尺寸剪取合适大小的Whatmann滤纸及硝酸纤维素膜，上下各一层滤纸，中间为胶和膜，胶在负极，膜在正极，用玻棒赶除气泡，采用半干式转膜，恒压20 V，时间根据相应的蛋白KD数进行调整，转移蛋白到硝纤膜；

3）丽染和封闭：将转入蛋白的硝纤膜浸入丽春红工作液中，染色2～5 min后，蒸馏水冲洗，观察转膜效率，标记蛋白，用PBS洗去丽春红染料。条带用1% BSA，37°C封闭1 h；

4）抗体孵育：弃封闭液，用PBS将BSA清洗干净，封口机将各条膜封闭于自封袋中，尽可能排除气泡。一抗用PBST稀释至工作液浓度，37°C恒温摇床反应1～2 h，4°C孵育过夜；用PBST清洗3次，10 min/次。用PBST稀释二抗至工作液浓度，按前法封袋，37°C恒温摇床避光反应1 h。反应结束后弃二抗，用PBST清洗3次，10 min/次。

5）扫描结果：PBST清洗3次；PBS清洗次，6 min/次；用Odyssey近红外荧光扫描成像系统扫膜

参考文献：

[1] Bernstein CN, Fried M, Krabshuis JH, et al. World Gastroenterology Organization Practice Guidelines for the diagnosis and management of IBD in 2010 [J]. Inflamm Bowel Dis, 2010, 16(1):112-124.

[2] Kukidome D, Nishikawa T, Sonoda K, Imoto K, Fujisawa K, Yano M, Motoshima H, Taguchi T,

Matsumura T and Araki E. Activation of AMP-activated protein kinase reduces hyperglycemia-induced mitochondrial reactive oxygen species production and promotes

mitochondrial biogenesis in human umbilical vein endothelial cells. Diabetes. 2006; 55(1):120-127.

附录

综述

GL-V9抑制DSS诱导小鼠结肠炎

结肠炎是一类因免疫反应失调所致的反复发作的肠道慢性炎症性疾病。目前其病因尚不清楚,多认为其是环境、遗传、感染和免疫多种因素综合作用的结果。其中免疫异常被认为是该病发病的重要因素，主要包括自身抗体、细胞免疫、细胞因子、环氧合酶与基质金属蛋白酶、氧自由基和一氧化氮等。

1. ROS活性氧与炎症性肠病

活性氧是指在生物体内与氧代谢有关的含氧自由基和易形成自由基的过氧化物的总称如超氧自由基(·O₂^-)、过氧化氢(H₂O₂)、羟自由基(·OH)等等，活性氧可使类脂中的不饱和脂肪酸发生过氧化反应，破坏细胞膜的结构。氧化应激被认为是UC的主要病理机制，而活性氧

(reactive oxygen species, ROS)自由基是氧化应激的分子基础^[1]。UC伴有ROS的升高，UC的始发和进展都与ROS在细胞内的变化有一定联系。

1. AMPK通路

腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）在真核细胞生物中广泛存在。AMPK是一个异源三聚体蛋白，由alpha;（63kD）、beta;（30kD）和gamma;（37-63kD）三个亚基组成，AMPK亚单位在不同组织器官分布不同，所形成的三聚体亦各异，可能与组织特异性靶分子有关^[2]。在运动、缺血、缺氧等情况下，细胞内AMP/ATP比值显著升高时，AMPKalpha;亚基Thr172磷酸化后被激活。AMPK的下游靶蛋白主要与能量代谢调节有关，通过调控代谢相关酶起作用。AMPK激活后增加脂肪酸摄取和氧化,加速葡萄糖摄取，刺激糖酵解，增加ATP生成。因此，AMPK被看做能量的调节器,调节整个机体和细胞内能量的利用。近来实验结果显示AMPK通过抑制诱导性一氧化氮合酶（iNOs）进而起到抗炎作用。

3. FOXO3a转录因子

Forkhead转录因子是2000年才正式统一命名的一个新的转录因子家族，该家族共同特征是具有一个长110个氨基酸的保守的DNA结合结构域。Forkhead转录因子目前被分为17个亚家族，其中研究最深入的是O家族（FOXO），包括FOXO1、FOXO3a、FOXO4[3]。其中FOXO3a 的异常表达，可能与肿瘤的发生密切相关，例如继发性急性白血病与 MLL 基因与此基因的易位相关联。癌症中常见的是FOXO3a基因的下调，FOXO3 被称为肿瘤抑制器。

1. 硫氧还蛋白-1（Thioredoxin-1，Trx-1）

硫氧还蛋白系统结构：TRX、TR（thioredoxin reductase，TR）和还原型辅酶NADPH。TRX主要分为TRX-1和TRX-2两型，TRX-1主要存在于细胞质和细胞核中，而TRX-2仅存在于线粒体中。TRX-1系统的功能主要是：通过其氧化还原活性中心（Cys-Gly-Pro-Cys）构成的二硫键相互作用，还原蛋白质被氧化的巯基丙氨酸基团，反过来它又会被TRX还原酶和NADPH复位。TRX-1的生物活性包括抗氧化，生长抑制，抗凋亡，调节基因表达，在许多肿瘤病变和炎症组织中高表达^[4]。

5. 汉黄芩素抗炎作用相关研究

汉黄芩素是中药黄芩中的一种成分，属于黄酮类化合物。黄芩中的黄酮在体外抗炎作用方面表现出活性。

Chung评价了黄芩甲醇提取物及其黄酮类化合物的消炎作用以及激活龈成纤维细胞作用。浓度为1mu;g/ml的黄芩甲醇提取物以及黄芩苷、黄芩苷元和汉黄芩素，对脂多糖诱导的IL-1beta;合成降低了50%以上^[4]。

Nakamura N将黄酮与IL-1beta;用于离体ARPE-19细胞的培养基中。结果IL-1beta;以剂量依赖方式提高体外培养的人类视网膜色素上皮细胞产生IL-6、IL-8的能力。黄芩素、汉黄芩素明显抑制了IL-6、IL-8的产生及mRNA的表达^[5]。

参考文献

[1]Harris ML, Schiller HJ, Reilly PM, Donowitz M, Grisham MB and Bulkley GB. Free radicals and

other reactive oxygen metabolites in inflammatory bowel disease: cause, consequence or

epiphenomenon? Pharmacol Ther. 1992; 53(3):375-408.

[2] Xie Z, He C and Zou MH. AMP-activated protein kinase modulates cardiac autophagy in diabetic

cardiomyopathy. Autophagy. 2011; 7(10):1254-1255.

[3]Sengupta A, Molkentin JD, Paik JH, DePinho RA and Yutzey KE. FoxO transcription factors

promote cardiomyocyte survival upon induction of oxidative stress. J Biol Chem. 2011;

286(9):7468-7478.

[4]Tan A, Nakamura H, Kondo N, Tanito M, KwonYW, Ahsan MK, Matsui H, Narita M and Yodoi J. Thioredoxin-1 attenuates indomethacin-induced gastric mucosal injury in mice. Free Radic Res. 2007; 41(8):861-869.

[5] Chung CP, et al. Planta Med, 1995. 61:150.

[6] Nakamura N. The anti-inflammatory activity of scutellaria rivularis extracts and its active components, baicalin, baicalein and wogonin [J] . Medical and Life Sciences, 1996, 24( 1 ): 31- 36.