课题背景：
非编码 RNA (noncoding RNA， nc RNA) 是人类基因组学研究的重要领域，其中长度超过 200 bp 的长链非编码 RNA (long non-coding RNA， Lnc RNA)，占 80% 以上。长非编码RNA（lncRNA）在过去的十年中已成为生物医学研究的重点，现在被认为是影响发育、分化和代谢以及各种人类疾病病理学主要过程的重要的调节因子。LncRNA可以通过包括募集组蛋白修饰复合物，调节转录因子活性和剪接机制，增加mRNA稳定性和作为转录增强子的各种机制来控制基因表达。 LncRNA在各种生物过程中都起作用，包括基因转录，细胞分化，印记，免疫应答和干细胞多能性，并具有响应外部刺激的细胞特异性表达模式。MALAT1（转移相关肺腺癌转录物1），又名核富集常染色体转录产物 2 (nuclera-enriched autosomal transcript2， NEAT2)， 全长 6.7 kb，编码基因定位于染色体 11q13.1，普遍表达于人类和鼠的组织细胞中，尤以神经系统突出。MALAT1 最早于 2003 年在观察早期非小细胞肺癌 (non-small cell lung cancer， NSCLC) 的转移现象时被发现，并因此得名。在早期 NSCLC 具有后期转移倾向的细胞株中，其表达水平相对于无转移倾向细胞株显著上调，与患者生存率负相关。已有大量的文献报道MALAT1在缺血性脑卒中后内皮保护中的重要作用，寻找调控MALAT1的先导化合物及结构改造物用于缺血性脑卒中的治疗具有重大的科学意义。
报告基因是现代分子生物学研究领域中用于分析结构基因旁侧区域潜在的顺式元件（如启动子、增强子和沉默子等）和反式作用因子相互作用关系的一种重要工具， 在解析基因时空表达调控的内在规律中发挥着重要作用，它具有便捷、可靠、灵敏度高和适用于大规模检测等优点。目前所使用的报告基因基本可分为 4类：1）以转运功能为主，持续转运放射性离子进入转导细胞；2）选择性催化放射性或荧光底物发生反应的酶蛋白；3）不添加额外底物而发出自然荧光的荧光蛋白；4）能特异性捕获具有放射性、磁性或荧光标记的配体，抗原或半抗原的锚定在膜上的受体或抗体。报告基因能实时定量检测细胞活动和生理化学物质的变化情况，并且具有实时性、非侵入性、可靠性、易检测、可重复性、高敏感性、可用于大规模检测等优点，因此在植物基因工程、动物基因
高通量药物筛选(High throughput screening， HTS)技术是20世纪80年代后期发展起来的一种用于寻找新药的高新技术，由于该技术的快速、高效等特点，受到国际药物研究机构的极大重视，在短短数年内，就成为新药发现过程中的主要技术手段，被国际大多数医药研究机构广泛采用，并因此得到快速的发展。传统的药物筛选方法是采用药理学的实验方法，通过体内、体外的多种实验方法，评价药用样品的药理活性。但是，由于传统的药理实验方法需要消耗大量样品，使用大量实验动物，参加实验的技术人员具有较熟练的操作技能，而且筛选样品量有限，劳动强度大，不能适应大量样品的同时筛选。高通量药物筛选是在传统的筛选技术基础上，应用先进的分子生物学、细胞生物学、计算机、自动化控制等高新技术，建立的一套更适合于药物筛选的技术体系。高通量药物筛选技术是将多种技术方法有机结合而形成的新的技术体系，它以分子水平和细胞水平的实验方法为基础，以微板形式作为实验工具载体，以自动化操作系统执行实验过程，以灵敏快速的检测仪器采集实验数据，以计算机对实验获得的数据进行分析处理，在同一时间内对数以千、万计的样品进行检测，并以相应的数据库支持整个技术体系的正常运转。分子水平和细胞水平的实验方法(或称筛选模型)是实现高通量药物筛选的技术基础。由于高通量药物筛选要求同时处理大量样品，实验体系必须微量化。这些微量化的实验方法有些是应用传统的实验方法加以改进建立的，更多的是根据新的科学研究成果建立的。高通量药物筛选应用的实验方法总体积一般要求在2～ 250mu;L，常用的高通量药物筛选模型可以根据其生物学特点分为以下几类:①受体结合分析法。②酶活性测定法。③细胞因子测定法。④细胞活性测定法。⑤代谢物质测定法。⑥基因产物测定法等等。以上这些方法都已经广泛应用于高通量药物筛选中。
利用构建在HUVEC细胞上的MALAT1-Luc报告基因体系这种方法， 进行高通量筛选MALAT1调控化合物具有高效，高灵敏度的特点，但是所涉及的各种实验参数需要优化，比如点板细胞数，细胞裂解液体积，酶与底物的体积比及反应时间，阳性药的选择，体系稳定性的评价等。以上参数的优化实验及相关的细胞操作实验成为本次实验研究的重点内容。
实验设计流程：
1.人脐静脉内皮细胞（HUVEC）的培养、传代、点板；
2.点板细胞数的优化
本报告基因筛选体系使用96孔细胞培养板，为得到最优的点板细胞数，设置每孔1000，1500，2000，2500，3000，3500，4000，4500，5000细胞数，固定细胞裂解液体积，酶与底物的体积比及反应时间，以DFO为阳性药，检测最大荧光值时的最少细胞数，即为最优细胞数；
3. 细胞裂解液体积、酶与底物的体积比及反应时间的优化
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