开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）
- 国内外研究进展：
RISPR序列于1987年在大肠杆菌的基因组中首次发现，随后经过科学家20多年的不断研究，2013年，科学家正式利用 CRISPR系统在人类细胞和小鼠细胞中实现了基因编辑。之后，CRISPR/Cas9作为第三代基因编辑技术体现了巨大的优势。 CRISPR/Cas9 系统已经迅速成为医学领域最具潜力的基因编辑工具， 它是继锌指核酸内切酶 (zinc-finger nucleases， ZFNs)和转录激活子样效应因子核酸酶(transcription activator-like effectors nucleases， TALENs)之后的第三代人工改造的核酸内切酶，被喻为“基因魔剪”（ Hatoum et al., 2014）。该基因编辑系统最大优势在于只需要设计一个靶向目标序列的 sgRNA(single-guide RNA)就能引导 Cas9 核酸酶结合到特定的基因序列，并指导 Cas9 核酸酶切割相应的结合位点，进而完成对靶基因的编辑。由于其设计简单、实施快捷、成本低廉，突变效率高等优点，这一系统在基因组功能鉴定、抗病毒、抗肿瘤、免疫治疗等众多领域已广泛研究(Chylinski et al.,2014)。虽然 CRISPR/Cas9 系统具有如此多的优点，但是其可能存在的脱靶风险影响了该基因编辑技术的深入研究，增加了用于疾病治疗的风险，阻碍了临床的进一步应用。如何保证 CRISPR/Cas9 基因编辑技术高编辑效率，同时也能降低脱靶效应，这将是未来科学研究者深入研究 CRISPR/Cas9 技术并开拓其临床应用亟待解决的问题。
CRISPR/Cas 系统是存在于细菌及古生菌中的一种有效的抵御外来噬菌体或质粒侵袭的获得性免疫系统，主要由前导序列、多段高度保守的重复片段和间隔片段串联序列、CRISPR 相关蛋白基因(Cas genes)组成。根据其基因序列及核心要素的不同，将不同物种中的 CRISPR/Cas 系统分成 3 种类型： Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型，Ⅱ型的标记基因是 Cas9 (Chylinski et al., 2014)。re-crRNA 转录的同时，与其重复序列互补的反式激活 crRNA(trans-activating crRNA， tracrRNA)也被转录出来。Cas9 蛋白含有 2 个活跃的酶切位点，包括氨基末端的 RuvC 和蛋白质中部的 HNH位点，其中 RuvC 负责非互补链的切割， HNH 负责互补链的切割。tracrRNA 协同 Cas9 蛋白可以产生成熟 crRNA。crRNA、tracrRNA 和 Cas9 组成复合体，识别并结合于 crRNA 互补的外源 DNA，然后解开 DNA 双链，形成 R 环结构，使 crRNA与互补链杂交，另一条链保持游离的单链状态，然后由 Cas9 2 个酶切位点分别对 DNA 双链进行切割，最终导致 DNA 双链断裂。tracrRNA 和 crRNA可 以 融 合 成 为 一 个 向 导 RNA (single-guideRNA，sgRNA) Cas9 蛋 白 具 有 细 胞 核 定 位 信 号 (nuclear localization signal， NLS)，能够与 sgRNA 结合并组装成 sgRNA-Cas9 复合体，对 PAM 区(proto spacer adjacent motif)上游的 17～20 bp 靶序列进行定点编辑，引起 DNA 双链断裂(Jinek et al., 2102)。PAM 区由 NGG 序列构成， N 为 A、G、C、T 中任一碱基。当 DNA 双链发生断裂时，细胞通过同源介导的双链 DNA 修复(homology directed repair， HDR)和非同源末端连接(non-homologous end joining， NHEJ)的方式进行自我修复。HDR 会以另外一条同源染色体为模板，进行基因修复， HDR 通常不会引起突变。但是，NHEJ 的修复方式具有易错倾向，容易在断裂位点发生碱基插入或缺失，造成移码突变，引起目标基因的功能缺(Deltcheva et al.,2011)。目前 CRISPR/Cas9 技术正是主要利用这一特点实现对特定 DNA 片段的敲除。由于人类基因组中存在丰富的 NGG 序列，因此该系统几乎可以靶向编辑人类基因组中的任何一种基因。
CRISPR/Cas9 技术展示了其特有的优势，开创了基因编辑的新时代，这种新型基因组编辑技术已经在生物工程、医学领域、农业、环境领域的研究中得到了广泛应用。在临床治疗中，与蛋白质水平的治疗方式相比，基因治疗具有更加直接高效、成本低廉的特点。 CCRISPR/Cas9作为目前最先进的基因编辑技术，在功能基因的筛选和定点编辑、药物靶点的筛选验证、动物模型的构建和遗传疾病治疗中进行了广泛的利用(Wiedenheft et al., 2012)。比如：Lin等证明CRISPR/Cas9介导的基因编辑可以用于乙肝治疗；利用CRISPR/Cas9将造血干细胞中CD33失活可以对急性髓性白血病进行CAR-T细胞免疫治疗(Kim et al., 2019)；通过CRISPR/Cas9单点基因组编辑可以校正心肌肌营养不良症(Long et al., 2019)；同时，在犬模型中利用CRISPR/Cas9定点编辑肌营养不良基因可以恢复Duchenne肌营养不良(Amoasii et al., 2018)。以上研究表明CRISPR/Cas9在科学研究、药物研发及疾病治疗中具有举足轻重的作用。
随着CRISPR/Cas9基因编辑技术的不断发展，脱靶、编辑效率问题随之产生，但是经过科学家们的不断努力与优化，脱靶及编辑效率问题逐渐改善，得到了很大的提高。比如提高sgRNA的特异性、控制sgRNA/蛋白的用量，改造Cas9蛋白等。相较于脱靶问题，编辑效率问题也一直是科学家致力解决的问题，除了通过改变sgRNA及Cas9蛋白本身的特性之外，而研究热点主要集中在转染方法及CRISPR/Cas9的传输形式上，相较于转染方法，CRISPR/Cas9的传输形式上的改变对于CRISPR/Cas9编辑效率的提高至关重要。目前，传输形式主要分为3类： CRISPR/Cas9以质粒、sgRNA/Cas9 （mRNA）及sgRNA/Cas9蛋白RNP(Ribonucleoproteins)的形式。相较于质粒及mRNA形式的传输， RNP形式的CRISPR/Cas9传输系统操作简单、方便，但是目前大多Cas9蛋白对原代细胞较难转染,极大地限制了其应用。所以，筛选优异的表达载体及菌株，优化纯化工艺，开发针对较难转染细胞的Cas9蛋白，提高编辑效率对于基因编辑具有重要意义。
参考文献：
- Hatoum-Aslan A, Maniv I, Samai P, et al. Genetic characterization of antiplasmid immunity through a type Ⅲ-A CRISPR-Cas system. Journal of Bacteriology, 2014, 196(2): 310-317
- Reeks J, Naismith J H, White M F. CRISPR interference: a structural perspective. The Biochemical Journal, 2013, 453 (2):155-166
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Chylinski K, Makarova K S, Charpentier E, et al. Classification and evolution of type Ⅱ CRISPR-Cas systems. Nucleic Acids Research, 2014, 42(10): 6091-6105
Jinek M, Chylinski K, Fonfara I, et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science, 2012, 337(6096): 816-821
Deltcheva E, Chylinski K, Sharma C M, et al. CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase Ⅲ.
Nature, 2011, 471(7340): 602-607 - Wiedenheft, B., Sternberg, S.H. amp; Doudna, J.A. RNA-guided genetic silencing systems in bacteria and archaea. Nature 482, 331-338 (2012).
- Long, C., et al. Correction of diverse muscular dystrophy mutations in human engineered heart muscle by single-site genome editing. Science advances 4, eaap9004 (2018).
- Kim, M.Y., et al. Genetic Inactivation of CD33 in Hematopoietic Stem Cells to Enable CAR T Cell Immunotherapy for Acute Myeloid Leukemia. Cell 173, 1439-1453 e1419 (2018).
- Amoasii, L., et al. Gene editing restores dystrophin expression in a canine model of Duchenne muscular dystrophy. Science 362, 86-91 (2018).
- 拟研究或解决的问题
筛选优异的表达载体及菌株，优化纯化工艺，开发针对较难转染细胞的Cas9蛋白，提高编辑效率。
3. 研究手段：
1）目的基因获取：通过NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）已经释放的基因组序列信息，获取Cas9基因的CDS序列，设计特异引物对目的基因进行扩增，测序，获得正确的，对目的基因进行密码子优化，获得密码子优化后的目的序列。
2）不同重组载体的构建：选择不同的表达载体，对不同的表达载体进行核心元件的改造，添加诱导元件及相关标签，分别用于重组蛋白的高诱导表达及蛋白纯化；进而将目的基因通过酶切或同源重组的方法构建至已经改造的载体，形成重组载体。
