拟研究的问题：缺血性脑中风已成为继心血管疾病和癌症后的又一大致死疾病，并且具有较高的致残率和复发率，它的机制是一个十分复杂的多因素多机制多环节的病理级联反应过程。目前公认的缺血性中风的发病机制包括能量耗竭、炎症反应、一氧化氮（NO）损伤、血脑屏障（BBB）损伤和细胞凋亡等。其中脑缺血再灌注引起的血脑屏障损伤是缺血性脑中风的一个重要病理机制。Blebbistatin（Ble) 是最近发现的非肌球蛋白Ⅱ具有选择性抑制作用的小分子化合物，对广泛分布在哺乳动物血管内皮细胞的非肌肉肌球蛋白重链ⅡA(NMHCⅡA)有重要影响。所以我们拟研究Ble对氧糖剥夺诱导的小鼠脑微血管内皮细胞血脑屏障损伤的保护作用。
采用的研究手段：本实验选择小鼠脑微血管内皮细胞株bEnd.3作为工具细胞，采用MTT比色法检测细胞活力，通过缺氧时程考察制备OGD模型，利用细胞培养小室（Cell Culture Inserts）法，测定跨内皮细胞电阻（Trans-endothelial electrical resistant TEER）、荧光素钠白蛋白渗出率检测通透性变化，免疫印迹（Westerm blotting，WB）、免疫荧光（Immunofluorescemce, IF）方法观察连接蛋白表达，以期讨论OGD模型下微血管内皮单层屏障的损伤以及Ble对屏障的保护作用及其可能的机制。
- 采用MMT法测定Ble对OGD模型下bEnd.3细胞活力的保护
- 采用跨内皮细胞电阻法测定Ble对OGD模型下bEnd.3细胞屏障破坏的保护作用。
- 采用检测荧光素钠渗出率测定Ble对OGD模型下bEnd.3细胞屏障破坏后对渗漏程度的影响。
- 采用免疫蛋白印迹技术评价Ble对OGD模型下bEnd.3细胞屏障破坏后对紧密连接蛋白的影响。
- 免疫蛋白印迹技术测定Ble对OGD模型下bEnd.3细胞相关信号通路NF-kb以及MAPKs的影响。
文献综述：
中药调节氧糖剥夺诱导小鼠脑微血管内皮细胞屏障破坏的研究进展
摘要：缺血性脑损伤已成为继心血管疾病和癌症后的又一大致死疾病，并且具有较高的致残率和复发率，它的机制是一个十分复杂的多因素多环节多机制的病理级联反应过程，对于其的防治与药物研发日益受到全世界的广泛关注。本文综述了近年来国内外中药调节氧糖剥夺诱导的脑微血管内皮细胞屏障破坏的研究进展。
关键词：中药、缺血性脑损伤、血脑屏障、氧糖剥夺
1、血脑屏障概述
血脑屏障(blood brain barrier , BBB)存在于脑组织和血液之间，是一个复杂的细胞系统，控制着血液和中枢神经系统的交互。主要由脑微血管内皮细胞、内皮细胞外连接的基底膜和酶屏障、星形胶质细胞等构成, 其基本功能是阻挡病原体和其他大分子物质由血液循环进入脑组织和排除脑内代谢产物，以维持脑组织内环境的相对稳定，其通透能力与中枢神经的变性、损伤和炎症等密切相关。
BBB内皮细胞之间的连接由紧密连接（Tight junction，TJ）和黏着连接（Adherent junction,AJ）构成。TJ是BBB的结构基础，其包含膜内在蛋白和胞质辅助蛋白两种。膜内在蛋白又由闭合蛋白（claudin）、咬合蛋白（occludin）和连接黏附分子组成。胞质辅助蛋白包括闭锁小带蛋白（Zonu la Occludens protein,ZO-1、ZO-2、ZO-3）、扣带蛋白等多种蛋白。AJ由钙黏蛋白-连环蛋白复合体及其相关蛋白组成[1]。
2、脑缺血再灌注后引起血脑屏障损伤的因素
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