生脉散活性成分群对缺氧复氧诱导大鼠原代心肌细胞损伤的作用研究文献综述

 2022-12-09 14:52:42

开题报告

一、拟研究或解决的问题：

本课题拟在前期研究基础上，制备缺氧/复氧诱导大鼠原代心肌细胞损伤模型，以模拟临床上心肌缺血再灌注损伤，探讨生脉散活性成分群的保护作用机制，为其临床应用提供药理学依据。

二、采用的研究手段：

1 原代新生大鼠心肌细胞的分离与培养

取3天龄左右的新生大鼠，消毒后取心脏于冰冷的CBFHH缓冲液中，排出残余血液后将心室心房分离并剪成小块后转至离心管，加相应量胰酶、DNase母液进行消化。15 min后取出离心管，将上清液转移至装有血清的离心管中，再补加适量的胰酶溶液，重复操作。当杆状或椭圆状心肌细胞明显减少时可停止消化。再将收集到的消化液离心，弃去上清液，加入适量DMEM培养基重悬细胞。经滤网过滤后转移至培养皿，于培养箱中30~45 min。利用成纤维细胞贴壁速度快于心肌细胞的特性将这两种细胞分离开来。同时需补加100X Arac母液以抑制心肌细胞悬液中残存成纤维细胞的生长。约24h后心肌细胞多数贴壁并开始出现自发搏动，更换DMEM培养基并补加AraC。继续培养12 h后，心肌细胞充分伸展，多成梭形或三角形，自发搏动明显，此时心肌细胞可用于后续实验。

2 缺氧复氧模型的制备

选择生长良好状态均一的原代心肌细胞，建立物理学缺氧/复氧模型：将细胞用预先经94% N2 5% CO2 1% O2 混合气饱和1 h 的无糖培养基置换正常培养液，后放入通有94% N2 5% CO2 1% O2 的37 ℃培养箱缺氧培养3、6、9、12、24 h；再将缺氧后的心肌细胞换用预先用94% N2 5% CO2 1% O2 饱和的DMEM高糖培养基，在正常培养条件下复氧2、4、6、12 h。以确定最合适的缺氧/复氧时间。

3 MTT比色法测定细胞活力

各实验组细胞经处理后，加入已配制好的MTT溶液（5 mg/mL）孵育4 h后移弃培养液，每孔加入150 mu;L DMSO，振荡10 min，使结晶物充分溶解。用酶标仪在波长为570 nm处测定吸光度。并计算细胞活性。

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