糖基转移酶的结构改造文献综述

 2022-12-29 14:10:48
  1. 拟解决的问题

GT11对诺西肽的糖基化效率较低，因此通过对GT-11进行定点突变改造，提高其对诺西肽的糖基化效率。

研究手段

  1. 通过前期实验筛选得到的可能参与诺西肽糖基化的氨基酸残基，作为定点突变的对象。
  2. 通过对上述氨基酸进行丙氨酸扫描，采用全质粒扩增进行突变。
  3. 通过突变后的质粒在大肠杆菌中进行诱导表达，根据活性筛选得到该位置是否为催化的关键残基。
  4. 对突变的点进行分析。
  5. 文献综述

天然产物具有结构新颖性和多样性的特点, 同时具有多种生物活性, 是新药开发研究的重要来源之一 [1,2], 但是许多天然产物存在很多缺点，包括生物活性较差、生物利用度低、发挥作用的特异性差以及毒副作用大等, 因此需要通过结构修饰和改造来改善天然产物的性质 [3]。

天然产物的结构修饰和改造包括乙酰化、甲基化、糖基化、羟基化等, 这些修饰可丰富天然产物的多样性, 同时可以不同程度地提高天然产物的生物活性和生物利用度 [4,5,6] 。糖基化反应是天然产物生物合成过程中的一个重要修饰反应，一般参与天然产物合成过程中的最后一步反应，有助于形成次级代谢产物的多样性和复杂性，尤其能改善天然药物的成药性，增强其水溶性和稳定性。

糖基转移酶是催化单糖基团从糖基供体向受体底物转移并形成糖苷键的一类酶，其糖基受体种类广泛包括蛋白质、脂质、糖类、核酸和各种小分子次级代谢产物等 [7] ，反应效率高且条件温和，是天然产物结构修饰改造的重要工具酶之一。

目前普遍认可的糖基转移酶分类方法是按照氨基酸序列相似度来进行分类，CAZy数据库对已报道的糖基转移酶进行了分类，根据氨基酸序列相似度、催化机制等差异，将其分为106个家族 [8]。根据糖基转移酶的三维结构的折叠特征, 可以将糖基转移酶分为GT-A, GT-B, GT-C和GT-D 4种[9]。而根据糖基转移酶所催化形成的糖苷键类型分类，又可分为O-糖苷键类糖基转移酶、N-糖苷键类糖基转移酶、S-糖苷键类糖基转移酶、C-糖苷键类糖基转移酶等，其中，催化植物天然产物形成的糖基转移酶以O-糖苷键型为主，少数为N-糖苷键型和S-糖苷键型 [10] 。根据糖基化底物和产物的立体化学异构性, 糖基转移酶的催化机制可以分为两类, 即构型保持型和构型翻转型 [11] 。其中明确的是构型翻转型的催化过程是受体分子的活泼氢被糖基转移酶的碱性氨基酸夺取, 随后受体分子上的氧负离子从另外一侧进攻供体分子的异头碳,形成一个oxocarbenium离子样过渡态,磷酸基团脱离,完成构型翻转催化过程,[12]而构型保持型的催化机理则存在很大争议,其催化机制尚无定论[11]。

诺西肽是1980年被发现由活跃链霉菌、抗生素链霉菌和青灰色链霉素产生的e系列硫肽类化合物。研究发现，硫肽类化合物的抗菌机制是通过与细菌核糖体50S大亚基中23S rRNA以及L11 蛋白结合形成复合物，抑制L11蛋白的构象转变，进而影响蛋白质合成过程中肽链的转座而达到抗菌效果[13]。但较差的水溶性和化学结构稳定性导致诺西肽血药浓度低、体内抗菌活性极其微弱。与诺西肽相比，诺卡氏菌产生的另一同系列硫肽类抗菌化合物诺卡沙星则具有很强的体内抗耐药菌活性，比对诺西肽和诺卡沙星结构、理化性质、体内外活性推测二甲氨基葡萄糖的修饰致使诺卡沙星呈现体内抗菌活性 [14] 。

虽然化学合成法也可实现不同苷元受体的糖基化,但化学反应条件通常较为苛刻,需要保护和脱保护等多步反应,很难实现特定位置的糖基化修饰。同时, 原料试剂和副产物易对环境造成污染。糖基转移酶具有良好的区域或位置选择性和立体选择性，这一催化特性是实现特定位置的糖基化修饰的优势，但对含有多个可修饰位点的天然药物实现不同羟基多样化的糖基化修饰而言也存在很大的不足，针对每个糖基化位点需要具有特定区域选择性的糖基转移酶。不仅如此，即使具有相同位置选择性的糖基转移酶，也呈现出不同的催化活性 [15] 。因此，为促进天然药物的糖基化修饰研究，需要分离鉴定功能多样的糖基转移酶基因。通过筛选糖基转移酶酶库获得可生物合成糖基化诺西肽的糖基转移酶，对诺西肽进行糖基化修饰。

基因定点突变技术通过对酶的编码基因基进行定点改变或缺失，从而探索特定氨基酸残基对酶功能的影响。丙氨酸扫描是对酶进行改造的一种突变手段，是将识别的关键氨基酸残基全部突变成丙氨酸，然后通过评估侧链基团的大小、极性和所带电荷对酶功能的影响，来确定特定功能所需的关键氨基酸残基 [16] 。

参考文献

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