重组人胰岛素的分离纯化和分析鉴定
摘要：应用生物药物生产技术，构建工程菌，发酵后收集产物，产物蛋白经液固分离得到胰岛素前体，先通过凝胶亲和层析、一次反相层析除去杂质，胰岛素原酶切后沉淀冻干进行转肽反应，二次反相层析分离纯化后脱去保护基团，再经离子交换层析和三次反相层析得胰岛素精品，并运用高效液相色谱（HPLC）进行检测。
关键词：重组人胰岛素 分离纯化 分析鉴定 HPLC
背景介绍：近30年来，我国糖尿病患病率显著增加，胰岛素治疗是控制高血糖的重要手段。目前重组人胰岛素的生产方法主要有两种:1.以基因工程大肠杆菌分别发酵生产人胰岛素的A，B 链，然后经化学氧化法，使2条链在一定条件下形成二硫键，得到重组人胰岛素，这一方法目前已较少使用。2.用基因工程大肠杆菌或酵母菌发酵生产胰岛素前体，经过酶切、纯化等步骤，形成有活性的胰岛素，这是基因工程技术生产胰岛素常用的途径。
实验原理：运用基因工程技术生产胰岛素，工程菌发酵后收集游离在胞外的产物蛋白，即胰岛素前体，前体蛋白先经凝胶亲和层析除去色素及其他杂质。通过一次反相层析进行浓缩，恒温酶切后沉淀冻干，溶解冻干产物进行两步转肽反应，反应过程中需保护B链的苏氨酸基团；二次反相层析沉淀冻干后得纯化的胰岛素原，进行脱帽反应除去保护基团得胰岛素粗品。粗品胰岛素经阴离子交换层析脱盐，三次反相层析纯化，沉淀结晶冻干后得到较高浓度的胰岛素产物，经HPLC检验后可进行定性和定量分析。
实验原料：发酵后经预处理的胰岛素原样品
实验方法：
1. XAD-7大孔树脂亲和层析
树脂吸附色素及其他杂质，胰岛素原流穿。
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