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文献综述
- 木糖苷酶
beta;-木糖苷酶在自然界中分布非常广泛，现已从细菌、放线菌和真菌（包括酵母）等微生物和高等植物中分离得到。beta;-木糖苷酶是一种外切酶，主要催化水解木糖苷和以外切方式从非还原性末端水解木二糖及木二糖以上的低聚木糖，水解产物为木糖。木聚糖类半纤维素酶解时一般由木聚糖酶从主链内部先作用于长链木聚糖的糖苷键上，将木聚糖随机切成不同链长的低聚木糖，再由beta;-木糖苷酶作用于低聚木糖的末端，将这些短链低聚木糖降解成木糖。beta;-木糖苷酶还可以作用于萜类、甾体等甙元与木糖形成的糖苷键，释放出甙元。
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- 木糖苷酶的分类
beta;-木糖苷酶 (1,4-beta;-D-xylan xylohydrolase，EC 3.2.1.37)分类的根据是对木二糖或低聚木糖的亲和力。木糖苷酶可以水解小分子低聚木糖或者木二糖，将其降解成单糖。在木质纤维素应用过程中，是提高利用率的重要辅助酶，它不仅能产生木糖，还能抑制木聚糖最终水解产物的反馈抑制作用。木聚糖降解需要复杂的酶系，其中最主要的的酶是木聚糖酶和木糖苷酶。木糖苷酶可从真菌、细菌、酵母、海洋藻类、原生动物、蜗牛、甲壳类动物、昆虫、种子等获得，但商业应用来源是丝状真菌。通常，纯化后的beta;-木糖苷酶不能水解木聚糖，且木糖苷酶与低聚木糖的亲和力与其聚合度成反比，但是能降解人工底物，如pNP-beta;-D木吡喃糖苷。
1991年Herissat等提出根据氨基酸序列的相似性把糖基水解酶分成不同的家族，来自不同有机体的beta;-木糖苷酶分别属于第3、第39、第43、第52和第54族糖基水解酶（Glycoside hydrolases），见表1。真菌和高等植物产生的beta;-木糖苷酶大都属于第3族糖基水解酶。
表1 beta;-木糖苷酶的分类
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家族 |
来源 |
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第3 |
Arabidopsis, Barley, Talaromyces emersonii, Aspergillus niger,Aspergillus nidulans, Aspergillus oryzae, Trichoderma reesei |
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第39 |
Thermoanaerobacterium saccharolyticum |
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第43 |
Clostridium stercoarium, Bacteriodes thetaiotaomicron, Prevotella ruminico, Streptomyces coelieolor, Clostridium acetobutylicum |
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第52 |
Geobacillus stearothermophilus |
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第54 |
Hypocrea koningii G-39 |
1.2 beta;-木糖苷酶的酶学性质
已纯化的beta;-木糖苷酶有胞内型（如Streptomyces thermoviolaceus OPC-520）、胞外型（如Aureobasidium pullulans）和膜结合型（如Streptomyces sp. EC 10）。纯化后的beta;-木糖苷酶一般不具有其它酶活性，但是也有不少beta;-木糖苷酶被证明为双功能酶或多功能酶。如来自 T.reesei、Butyrivibrio fibrisolven、Clostridium sterco-rarium 和Barley 的beta;-木糖苷酶同时具有阿拉伯糖苷酶的活性。这些双功能酶大都含有属于不同糖基水解酶家族的催化结构域。
通常细菌或真菌只产生一种beta;-木糖苷酶，而对高等植物产生的beta;-木糖苷酶的研究显示，许多植物都具有不止一种beta;-木糖苷酶。2004年，MinicZ[1]首次报道了双子叶植物（拟南芥）中beta;-木糖苷酶的特性。纯化到的两种beta;-木糖苷酶XYL4和XYL1分子量分别为67 kD和64 kD。其中XYL4具有典型的beta;-木糖苷酶的特点，而XYL1是一个双功能酶，同时具有alpha;-L-阿拉伯糖苷酶和beta;-木糖苷酶活性。
已报道的beta;-木糖苷酶的等电点多数为弱酸性，而从Fusarium verticilioides和Talaromyces emersonill中分离到的beta;-木糖苷酶的等电点分别为7.8和8.9。beta;-木糖苷酶的最适pH一般在3.0 ~ 5.0，较多研究表明真菌合成的beta;-木糖苷酶最适pH为弱酸性。各种不同来源beta;-木糖苷酶的性质见表2。
表2 几种不同来源的beta;-木糖苷酶的性质
|
来源 |
分子量（kD） |
等电点 |
最适pH |
最适温度/℃/ |
|
Aspergillus arnonarius |
100 |
4.4 |
4.0 |
60 |
|
Aspergillus nidulans |
180 |
3.4 |
5.0 |
50 |
|
Aspergillus niger |
253 |
4.9 |
||
|
Aspergillus phoenicis |
132 |
3.7 |
4.0-4.5 |
75 |
|
Aspergillus phoenicis |
85（胞内型）/ 90（胞外型） |
|||
|
Aspergillus pulverulentus 1 |
180 |
4.7 |
2.5-3.5 |
60 |
|
Aspergillus pulverulentus 2 |
190 |
3.5 |
4.0-5.0 |
60 |
|
Bacillus thermantarcticus |
150 |
4.2 |
6.0 |
70 |
|
Clostridium cellulolyticum |
7.5 |
35 |
||
|
Clostridium stercorarium |
3.5 |
80 |
||
|
Fusarium proliferatum |
91.2 |
4.5 |
60 |
|
|
Fusarium verticillioides |
94.5 |
7.8 |
4.5 |
65 |
|
Humicola. grisea var thermoidea |
43 |
4.0 |
6.0 |
50 |
|
Neocallimastrix. Patriciarium 1 |
39.5 |
4.7 |
6.0 |
50 |
|
Neocallimastrix. Patriciarium 2 |
150 |
4.7 |
6.0 |
40 |
|
Penicillium wortmanni 1 |
110 |
3.7 |
3.0-4.5 |
55-65 |
|
Penicillium wortmanni 2 |
195 |
4.2 |
3.0-4.5 |
55-65 |
|
Penicillium wortmanni 3 |
210 |
4.6 |
3.0-4.5 |
55-65 |
|
Penicillium wortmanni 4 |
180 |
4.8 |
3.0-4.5 |
55-65 |
|
Potato |
39-40 |
5.1 |
4.0-4.5 |
50 |
|
Scytalidium thermophilum |
45（a）/38(b) |
7.1 |
5.0 |
60 |
|
Trichoderma harzianum |
60 |
4.0-4.5 |
70 |
|
|
Trichoderma koningiiG-39 |
104 |
4.6 |
3.5-4.0 |
55-60 |
注：a—SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定，b—分子筛测定
热稳定性是衡量酶的工业用途的重要参数。beta;-木糖苷酶的最适反应温度范围较大，多数在40 ~ 60℃。而近年来，从一些嗜热细菌和耐热真菌中分离到的beta;-木糖苷酶都有较高的热稳定性和最适反应温度。2004年，Lama L[2]从墨尔本火山坑附近的地热土中分离到嗜热芽孢杆菌（Bacillus thermantarcticus），其beta;-木糖苷酶活性可在60℃保持1 h以上，最适反应温度为70℃。同年Suryani[3]等人从Clostridium stercorarium得到的beta;-木糖苷酶最适反应温度达80℃。此后，Rizzatti AC[4]从耐热真菌Aspergillus phoenicis 中分离到两种beta;-木糖苷酶，分别为胞内型和胞外型。二者的最适反应温度分别达到85℃和90℃。耐热菌株的出现有利于酶的贮存和工业化处理，具有很高的实用价值。
大多数beta;-木糖苷酶的活性受Hg2 的抑制。而来自Trichoderma koningii G-39的beta;-木糖苷酶活性却不受Hg2 影响。2004年Peyer[5]在研究马铃薯beta;-木糖苷酶时发现，该酶的活性可被 Ni2 和Cu2 所抑制，被Ca2 所诱导，并且具有典型的植物N-糖基化模式。这个酶有希望成为分析N-糖基化和免疫学研究中的 N-糖基化修饰的工具。同时Zanoelo FF[6]的研究也表明真菌Scytalidium thermophilum产生的beta;-木糖苷酶可被Ca2 所诱导。钙离子存在和不存在时，酶在65℃的半衰期分别为30 min和11 min。
1995年Gasparie A[7]对Prevotella ruminicola B1产生的beta;-木糖苷酶的研究发现细菌在木聚糖培养基上生长比在葡萄糖培养基上生长产生的beta;-木糖苷酶活性高出至少20倍。2001年Hiroshi Jsujibo[8]等证明Streptomyces thermoviolaceus OPC-520beta;-木糖苷酶的活性可被桦木木聚糖、木二糖和木三糖所诱导，而单糖如木糖、阿拉伯糖和葡萄糖不能诱导beta;-木糖苷酶的合成。向含桦木木聚糖的培养基中加入葡萄糖可强烈抑制beta;-木糖苷酶的合成，说明beta;-木糖苷酶对新陈代谢副产物的抑制作用十分敏感，而且beta;-木糖苷酶的合成受木聚糖诱导作用和葡萄糖抑制作用的双重控制。2004年Zanoelo FF对Scytalidium thermophilum beta;-木糖苷酶的研究发现，培养基中加入葡萄糖后可显著降低beta;-木糖苷酶的活性，而放线菌酮能阻断木聚糖对酶的诱导作用。与其它beta;-木糖苷酶不同（一般beta;-木糖苷酶几乎均受到木糖抑制），该酶活性几乎不受木糖影响。它的热稳定性和对木糖的高度耐受使其适于工业化应用，这也是该酶和其它已报道的beta;-木糖苷酶的重大区别和优点所在。
1.3 beta;-木糖苷酶的催化机制
随着对beta;-木糖苷酶研究的不断深入，人们对它的作用机制越来越清楚。2000 年 Li YK[9]研究发现在含3% ~5%甲醇的醋酸缓冲液中进行的酶水解反应表现出恒定的产物生成速率（甲基-木糖苷/木糖），这表明有中间复合物的存在。Vocadlo DJ[10]的研究也得出了上述结论。此后Jin Kuk Yang[11]确定了Thermoanaerobacterium saccharolyticumbeta;-木糖苷酶的晶体结构有两种形式：D-木糖-酶和共价连接的 2-脱氧11-2-氟-alpha;-D 木糖基-木糖苷酶中间体，这为推测的催化机制提供了直接的证据。现在认为木糖苷键的酶水解通过一般酸碱催化，需要两种特定残基的参与即一个质子供体和一个亲核试剂。这种水解通过两种主要机制分别产生异头构型的完全保留（保留型）或反转（反向型）。属于不同糖基水解酶家族的beta;-木糖苷酶通过两种主要机制中的一种来水解木糖苷键，第 3、第 39、第 52 和第 54 族beta;-木糖苷酶均采用保留型，而第43族beta;-木糖苷酶采用反向型。反向型beta;-木糖苷酶较少，多数beta;-木糖苷酶为保留型。反向型beta;-木糖苷酶采用直接置换机制，其中酶的一个羧基侧链作为一般碱而另一个羧基侧链作为一般酸。而保留型beta;-木糖苷酶则通过一个两步的双置换机制。第一步为糖基化：酸碱催化剂为糖苷键氧原子提供质子，同时伴随有底物糖苷键的断裂，然后由亲核试剂进攻糖的异构中心形成共价的糖基-酶中间复合物。第二步为去糖基化：酸碱催化剂对进入活性中心的水分子去质子，随后再由它去进攻糖基的异头碳原子，并取代糖基。其中限速步骤为糖基-酶中间复合物的断裂。 参与催化反应的功能性氨基酸残基也正在逐渐得到确认。1998 年 Vocadle[12]通过电喷雾 MS 证明Thermoanaerobacterium saccharolyticumbeta;-木糖苷酶（GH39）中 Glu277作为亲核试剂，2002 年他[13]又通过标记和定点突变实验确定位于高度保守序列 Asn-Glu-Pro中的 Glu160是催化过程中的酸碱催化剂。2001年Bravman T[14]也通过定点突变和序列分析证明Bacillus stearothermophilus beta;-木糖苷酶(GH52)参与催化的两个关键氨基酸残基为Glu337和Glu413。同时人们对参与底物识别的辅助功能残基也开始有所了解。Jin Kuk Yang的研究认为，Thermoanaerobacterium saccharolyticumbeta;-木糖苷酶的Glu323可能在识别底物低聚木糖的非还原端过程中发挥作用，而这些残基的确认还有待进一步的研究证明。
1.4 beta;-木糖苷酶的应用
1.4.1 在造纸漂白中的应用
造纸工业的污染问题，一直困扰着人类。传统工艺漂白的废水中含有大量的氯酚类、氯仿等有毒、致癌物质。随着废水中污染成分的指标要求越来越高，造纸工艺的改进得到人们的关注。研究表明生物酶在造纸漂白过程中可发挥作用。其中内切木聚糖酶和beta;-木糖苷酶共同作用可用于纸浆的漂白，其作用原理是内切木聚糖酶和beta;-木糖苷酶能分解纸浆中的半纤维素，将其降解成低聚木糖，促进后续的漂白试剂对纸张的漂白作用。卢庆华等[16]从米曲霉中筛选出高产的木聚糖酶，在用过氧化氢漂白后，用木聚糖酶助漂，当酶量6 U/g时，漂白的白度与化学法相比，提高了31%，节约了资源，效果明显。
1.5.2 在食品工业的应用
阿拉伯木聚糖的降解，需要木糖苷酶（EC 3.2.1.37）、阿拉伯呋喃糖苷酶（EC 3.2.1.55）和木聚糖酶的协同作用。木聚糖酶可转化一部分阿拉伯糖基的木聚糖，从而改变其在面包烘焙过程中的作用，潜在的影响生面团和成品的性能。DorneZ.M等研究报道，木糖苷酶和阿拉伯呋喃糖苷酶可切除多糖体非还端的单个糖，而木聚糖酶不具有此性能。不仅木聚糖酶可形成还原端木糖，木糖苷酶也能形成。在小麦粉揉制的生面团中，木糖苷酶对较小分子的阿拉伯木聚糖的酶活力比长碳链的阿拉伯木聚糖大。在阿拉伯木聚糖的降解过程中，木糖苷酶的水解能力较阿拉伯呋喃糖苷酶强，因此将木糖苷酶应用在面包烘焙过程中，具有重要意义。
1.5.3 在医药工业的应用
人参的主要成分是人参皂苷，人参皂苷具有较多的生理活性。其中人参皂苷Rg1的活性表现在具有使中枢神经兴奋、抗疲劳、改善记忆、提高学习机能等方面；Rh1 具有抗肿瘤等作用。紫杉醇是目前临床上供不应求的新型抗肿瘤药物，主要从红豆杉树皮中分离得到。由于它新颖的抗肿瘤机制和显著的抗肿瘤效果使紫杉醇自问世以来即受到各界的高度关注。然而紫杉醇在天然红豆杉中含量极低，这使它的进一步开发受到了限制。10-去乙酰紫杉醇木糖苷在红豆杉中的含量是紫杉醇的10倍以上，但其一般作为废弃物而无法利用。在结构上10-去乙酰紫杉醇木糖苷去掉7位木糖残基即变为10-去乙酰紫杉醇，后者很容易通过酰化形成紫杉醇。1998年Patel[17]等人利用Moraxella.sp beta;-木糖苷酶水解10-去乙酰巴卡亭III木糖苷和10-去乙酰紫杉醇木糖苷7位木糖残基，得到重要的中间产物10-去乙酰巴卡亭III和10-去乙酰紫杉醇，为紫杉醇的合成开辟了一条崭新的途径。
1.5.4 能源工业
木聚糖类半纤维素是一类极为丰富的自然资源，在造纸工业废料及农业废弃物中广泛存在，其降解产物可作为碳源生产各种发酵产物。因此，能将木聚糖水解为低聚木糖的木聚糖酶受到了广泛的关注，而与之相比beta;-木糖苷酶却未得到足够的重视。2003年 Tuncer M等人向纯的木聚糖酶中加入beta;-木糖苷酶后，发现底物桦木木聚糖分解为木二糖的量由28%增加到58%，这表明beta;-木糖苷酶在木聚糖降解为低聚木糖的过程中发挥了十分重要的作用。beta;-木糖苷酶将低聚木糖降解为木糖单体，而木糖又可被细菌及真菌转化成有价值的工业燃料如酒精等。
2. 紫杉醇
紫杉醇最早是从太平洋红豆杉茎皮中分离得到的一种具有独特抗癌活性的二萜类化合物，用于治疗卵巢癌和乳腺癌等。目前其临床适应症扩大到肺癌、头颈部癌、软组织癌、白血病和胃肠道癌，被认为是迄今人类发现的最有效的抗癌药物。然而由于紫杉醇在植物体中的含量甚微(一般在干树皮中的含量只有0.01%)，且作为其天然来源的红豆杉资源有限，多年来人们不断努力试图通过其他的方法得到紫杉醇，以解决其供应不足的问题。
2.1紫杉醇的来源
迄今为止， 化学半合成紫杉醇的方法无论从操作的可行性还是经济的角度，仍然是现实的扩大紫杉醇来源的主要途径.该方法利用可从红豆杉针叶中获得的 10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ(10-DABⅢ)作为原料，半合成得到紫杉醇及其类似物紫杉特尔。因此，缓解紫杉醇资源短缺问题的一个方法就是将可利用的紫杉烷类化合物转化为10-DABⅢ，以最终提高紫杉醇的产量。含木糖基(C-7位)的紫杉烷类化合物最初是由Senilh等人从欧洲红豆杉树皮中分离出来的，在西藏红豆杉树皮糖基-10-去乙酰基紫杉醇，7-木糖-10-去乙酰基三尖杉宁碱和7-木糖-10-去乙酰基紫杉醇C的含量分别达到了0.5%，0.02%和0.0075%。在云南红豆杉中，这些化合物的量也相当可观。而在紫杉醇的生产过程中，这些物质都是被当作废物丢弃的，既浪费资源，又污染了环境。因此，如果能将这些化合物转化为10-DABⅢ，就能够使珍稀资源得到充分利用[18]。
图1 紫杉醇的生物合成途径
（粗箭头表示多步反应，蓝色箭头表示一步反应，红色箭头表示没有被阐明的步骤）
紫杉醇的生物合成可分为3个阶段: ①紫杉烷环母核结构的合成，以巴卡亭Ⅲ为产物; ②苯基异丝氨酸侧链的合成; ③侧链与紫杉烷母核的C13位酰化连接，然后在侧链C2#39;位和C3#39;位分别被羟化和苯甲酰化，形成紫杉醇。紫杉醇的 生物合成途径见图1。
自1989年Christen首次报道利用细胞灯养技术生产紫杉醇后,红豆杉细胞悬浮培养的研究报告呈逐年增加趋势。研究范围涉及细胞株系的选择、细胞生长、紫杉醇生产及营养成分消耗的动力学、诱导物、菌体、激素的种类和浓度、糖的种类和浓度、生物过程的偶合、生物反应器的种类、培养环境等方面的内容。美国农业部的Christen和Gibson于1989年用太平洋红豆杉细胞培养生产紫杉醇及其类似物申报了专利，获得批准。该专利报道中，杉醇的鉴定方法是HPLC和紫杉醇特有的微管聚合试验，体培养基中紫杉醇的含量为1.0-3.0 mg/L。1992年NCL主持的第二次紫杉醇研讨会，Shuler及其合作者报道了细胞培养生产紫杉醇的动力学研究,培养天13可测到紫杉醇的存在,培养20天后紫杉醇含量迅速增加,培养物中紫杉醇含量为39 mg/L。
近年来，国内外进行愈伤组织培养的红豆杉种或变种已超过10个，其中大部分己证实有紫杉醇产生，研究较集中的是欧洲红豆杉、太平洋红豆杉、东北红豆杉、云南红豆杉等，选作诱导愈伤组织的外植体包括根、茎、叶、树皮、形成层、大配子体、种子胚、假种皮、幼茵胚轴等。
2.2 紫杉醇的获取
2.2.1 紫杉醇的提取和纯化
紫杉醇最早由Wall等从短叶红豆杉中提取分离得到，并于1971年报道其化学结构。Wall等对短叶红豆杉树皮的乙醇提取物用水和氯仿进行分配，氯仿部分采用Florisil，Sephadex LH-20和硅胶进行三次柱层析，最后由甲醇-水重结晶得到纯的紫杉醇。由于红豆杉树皮中紫杉醇的含量极低，约为0.007% ，所以，为了寻找新的资源，Witherup等[19]对6种红豆杉属植物的针叶和树皮进行了分析，主要用二氯甲烷和水对提取物进行分配，溶于二氯甲烷的部分用多种溶剂抽提后，进行梯度硅胶层析，最后用反相制备HPLC进行纯化;Cardel-lina[20]则用多步溶剂抽提法，加上正相的制备HPLC来达到纯化的目的。Wickremesinhe[21]认为上述的两种方法对于日常处理大量的植物细胞培养的样品而言是不现实的，因此提出对甲醇的提取物通过C18的反相柱进行收集，然后再通过C18反相制备HPLC进行纯化。Mathina[22]则提出了用C18固相提取法(solid-phase ex-traction，SPE)从粗提物中大量分离收集紫杉烷类化合物，并认为同上述的液-液分配相比较，SPE具有省时间和减少溶剂用量的优点。高速逆流色谱(HSCCC)是一种较为有效的分离方法，目前，也有报道用此方法来大量分离紫杉醇[23，24]，与常规的柱色谱比较，高速逆流色谱具有分离周期短、样品损失少、操作简便等优点。最近Ketchum[25]等在研究红豆杉细胞的水溶性培养液中紫杉烷的分离时发现，在用0.2mu;m的尼龙或PVDF膜过滤水溶性培养液时，这些膜对紫杉烷有拦截作用。大部分或几乎所有紫杉烷被收集在膜上，再用一定比例的甲醇或乙醇水溶液洗脱就能使这些紫杉烷通过滤膜。该方法可省去用溶剂分步提取或液-液分配萃取这一步，并能节省大量溶剂，也减少了氯代烷对环境的污染。
2.2.2 紫杉醇的分离与检测
由于紫杉醇与其它伴生的紫杉烷结构非常相似，所以使紫杉烷类化合物能够进行很好的分离是对紫杉醇进行准确定量的基础。二维薄层色谱技术在早期曾经用于紫杉烷的分离[26]，但以后HPLC逐渐显示出在分离这一类化合物方面的优势。在早期的研究中，美国国立癌症研究所(NCI)的Witherup[27]等对此作了许多工作，们在比较了C18、氰基和苯基柱分别对紫杉醇和5个紫杉烷类化合物的分离情况后指出，紫杉醇和cephalomannine在C18柱上很难分离，若要达到基线分离则需要较长的分离时间，且峰形变宽，而氰基和苯基柱则对6个化合物都有较好的分离度。在等度洗脱的条件下，也都有很好的线性范围，这对提取物中紫杉醇的含量测定提供了方便。比较氰基柱和苯基柱，虽然在氰基柱上的分离效果似乎更好一些，但是在分离短叶红豆杉树皮的甲醇提取物时可以发现，在保持相似的保留时间和分离度的情况下，采用氰基柱时，由于流动相中有机溶剂比例比采用苯基柱时低，因此会引起较高的柱压并使色谱柱的寿命减少。Wheeler[28]等在研究遗传、环境等因素对红豆杉中紫杉醇含量的影响中，也使用了苯基柱，但在流动相中以50 mmol/L的NH4Ac缓冲液(pH= 4.0)代替了水，从而消除了柱压升高的问题。Harvey[29]等认为，尽管氰基和苯基柱能对紫杉醇和cephalomannine的标准品达到基线分离，但在测定粗提物的含量时却有许多不足之处。例如许多成分在紫杉醇之后出峰，所以为了保证使那些保留时间较长的成分不对下次进样测定带来干扰，则持续的梯度洗脱是必不可少的;另外从图谱上看，在紫杉醇和cephalomannine出峰的一段时间内整个基线有明显的抬高，Harvey认为，基线的抬高很有可能是由一些未完全分离的基质化合物(matrix compounds)而引起的，并且还认为早期C18在分离紫杉醇和cephalomannine上的失败是由于柱效不高引起的。于是就用C18填料开发了一种柱效非常高的微型柱(microcolumn)，虽然紫杉醇和cephalomannine在微型柱上出峰较晚，但在等度洗脱的条件下能达到基线分离，从对短叶红豆杉的嫩枝和针叶提取物的测定中可以看出无明显干扰。用普通填料的反相高效液相色谱柱，如C18、氰基和苯基柱，虽然都能对紫杉醇和cephalomannine加以分离，但是都没有提到另一个非常难分离的紫杉烷类化合物7-表-10-去乙酰基紫杉(7-epi-10-deacetyl tax-ol)。Richheimer[30]首次报道了用两种新填料色谱柱:diphenyl和pentafluorophenyl(PFP)柱，对紫杉醇和cephalomannine以及两者之间的7-表-10-去乙酰基紫杉醇进行了基线分离。这两种柱的差异则表现在:diphenyl柱对稍早于紫杉醇洗脱的化合物有较好的分离，而PFP柱则对出峰较早的紫杉烷类化合物有较好的分离。这两种柱的运用，使得在用HPLC测定紫杉醇含量时，减少了杂质的干扰，测定结果更准确可信。Kopycki等[31]用3种不同的梯度洗脱方式考察了Gurosil G、Taxil(即PFP)和Supelcosil LC-DPdiphenyl柱对红豆杉针叶中紫杉烷类化合物的分离，认为Gurosil G柱在3种梯度条件下对紫杉烷都能达到满意的分离，PFP柱则与前面提到情况相似，而不同的梯度条件对diphenyl柱的影响不大。Ketchum等[36]在每周处理400份红豆杉样品的工作中用到了一些特殊填料的HPLC柱，包括Pheomenex 4mu;m TaxsolTM F柱和Metachem 5mu;m TaxsilTM柱，这些柱不用梯度就能使紫杉醇、cephalomannine和7-表-10-去乙酰基紫杉醇达到基线分离，且紫杉醇在13.5 min左右就出峰，最晚出峰的7-表紫杉醇也在20 min左右出完。苯基柱虽能解决这一问题，并使紫杉醇、cephalomannine和7-表-10-去乙酰基紫杉醇分开，但7-表-10-去乙酰基紫杉醇出峰在紫杉醇和cephalomannine之间，三者未能达到基线分离，且要使用梯度洗脱，完成一次分离约需65 min。Castor[37]在对另一种红豆杉(T.Media)针叶的研究中，通过改变流动相，在苯基柱上也使紫杉醇和cephalomannine以及两者之间的7-表-10-去乙酰基紫杉醇能够很好地分离，不过此时7-表-10-去乙酰基紫杉醇的出峰在紫杉醇之后。最近，吴锦霞等[38]用梯度洗脱方式，在C18柱上使紫杉醇、cephalomannine和7-表-10-去乙酰基紫杉醇达到基线分离，完成一次分离只需30min。这一方法的另一优点就是在测定紫杉醇注射剂时，可消除注射剂中的主要辅料cremophor EL对检测的干扰，而在PFP柱上，cremophor EL的干扰是非常明显的。
2.3 紫杉醇的理化性质
紫杉醇是二菇类化合物,有含氧四环的紫杉烷环及酯侧链,分子式C47H51NO4,分子量853.92,白色结晶粉末,易溶于氯仿、丙酮等有机溶剂。水溶性差,水中溶解度仅为0.006 mg/mL。与糖结合成苷后的水溶性大大提高,紫衫醇分子中虽有含氮取代基,但氮原子处于酰胺状态,邻近又有吸电子基,故不显碱性而为中性化合物。在pH4-8范围内紫杉醇比较稳定,碱性条件下很快分解,酸性条件下比较稳定。一定条件下紫杉醇可被氧化,但极难还原,其化学性质相对稳定,化学结构见图2。
图2 紫杉醇和7-木糖-10-去乙酰基紫杉醇的化学结构
红外吸收：红外光谱图中的主要吸收带与对照品一致。
HPLC鉴别：在含量检测中，检测制备的色谱图中主峰的保留时间与标准制备色谱图中主峰的保留时间一致。
纯度：99-100%，以无水无溶剂的干燥品计。
有关物质：相关物质总le;2.0%。
有机挥发性杂质：符合美国药典USP和中国药典CP有机挥发性杂质要求。
比旋度：[alpha;]20 D=-49.0°~55.0°（10mg/mL的甲醇溶液），以无水无溶剂的干燥品计。
水分：le;4.0%。
炽灼残渣：le;0.2%。
重金属：le;0.002%。
微生物限量：le;100cfu/g paclitaxel，符合对金黄色葡萄状菌、绿脓杆菌、沙门氏菌、大肠杆菌的无菌试验要求。
细菌内毒素：le;4.0%USPEU/mg paclitaxel。
2.3 7-木糖-10-去乙酰基紫杉醇
红豆杉中有一些成分与紫杉醇结构较为接近，如10-去乙酰紫杉醇、7-木糖-10-去乙酰基-紫杉醇、巴卡亭III、10-去乙酰巴卡亭等。在不同种类的红豆杉或红豆杉的不同部位中，紫杉醇干重含量仅为0.001-0.08％，但一些与紫杉醇结构相近的紫杉烷 含量比较高，如在云南红豆杉中，7-木糖-10-去乙酰基-紫杉醇的含量达到了干重的0.2-03％，是紫杉醇含量的10倍以上，在分离过程中却被当作废弃物，没有得到充 分的利用，造成了资源的极大浪费。由于7-木糖-10-去乙酰基-紫杉醇去掉木糖基即转变 为10-去乙酰紫杉醇，再在其10位上经过乙酰化反应即可形成紫杉醇。因此，探讨转化7-木糖-10-去乙酰基-紫杉醇为10-去乙酰紫杉醇的方法，对于解决紫杉醇的来源具有重要意义。
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资料编号：[82041]
文献综述
- 木糖苷酶
beta;-木糖苷酶在自然界中分布非常广泛，现已从细菌、放线菌和真菌（包括酵母）等微生物和高等植物中分离得到。beta;-木糖苷酶是一种外切酶，主要催化水解木糖苷和以外切方式从非还原性末端水解木二糖及木二糖以上的低聚木糖，水解产物为木糖。木聚糖类半纤维素酶解时一般由木聚糖酶从主链内部先作用于长链木聚糖的糖苷键上，将木聚糖随机切成不同链长的低聚木糖，再由beta;-木糖苷酶作用于低聚木糖的末端，将这些短链低聚木糖降解成木糖。beta;-木糖苷酶还可以作用于萜类、甾体等甙元与木糖形成的糖苷键，释放出甙元。
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- 木糖苷酶的分类
beta;-木糖苷酶 (1,4-beta;-D-xylan xylohydrolase，EC 3.2.1.37)分类的根据是对木二糖或低聚木糖的亲和力。木糖苷酶可以水解小分子低聚木糖或者木二糖，将其降解成单糖。在木质纤维素应用过程中，是提高利用率的重要辅助酶，它不仅能产生木糖，还能抑制木聚糖最终水解产物的反馈抑制作用。木聚糖降解需要复杂的酶系，其中最主要的的酶是木聚糖酶和木糖苷酶。木糖苷酶可从真菌、细菌、酵母、海洋藻类、原生动物、蜗牛、甲壳类动物、昆虫、种子等获得，但商业应用来源是丝状真菌。通常，纯化后的beta;-木糖苷酶不能水解木聚糖，且木糖苷酶与低聚木糖的亲和力与其聚合度成反比，但是能降解人工底物，如pNP-beta;-D木吡喃糖苷。
1991年Herissat等提出根据氨基酸序列的相似性把糖基水解酶分成不同的家族，来自不同有机体的beta;-木糖苷酶分别属于第3、第39、第43、第52和第54族糖基水解酶（Glycoside hydrolases），见表1。真菌和高等植物产生的beta;-木糖苷酶大都属于第3族糖基水解酶。
表1 beta;-木糖苷酶的分类
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