抗肾小球基底膜抗体肾炎小鼠模型的建立及应用文献综述

 2023-02-15 06:02

一、研究背景及意义

抗肾小球基底膜( GBM) 抗体肾炎的发生是由于抗 GBM 抗体结合在肾小球基底膜 IV 型胶原蛋白alpha;3 链的非胶原结构域上,此区域包含 EA 和 EB 表位与抗体结合【1】,从而导致 GBM 的功能丧失,致使肾炎发生。为了更好地研究抗 GBM 抗体诱导的相关疾病的病因、发病机制及治疗药物的发现,人们已经成功建立了多种实验动物模型。抗小鼠 GBM肾炎动物模型是较早的应用免疫学方法建立的实验动物模型之一,早在 1932 年由 Masugi 等建立【2】,该模型能在短期内诱导小鼠抗 GBM 抗体肾炎,并在临床表现及病理改变上与人抗肾小球抗体相关疾病有诸多相似之处,因此是研究该类疾病的一种理想的实验动物模型。本实验旨在前人研究的基础上加以改良,建立重复性高并且稳定的抗 GBM 抗体肾炎小鼠动物模型,为研究抗 GBM 抗体相关疾病的发病机制、寻找安全有效的治疗方法提供有价值的实验动物模型。

二、实验原理

抗肾炎是由抗抗体介导的肾小球毛细血管广泛损害的自身免疫性疾病,大多数表现为型新月体肾炎,起病急,短期内肾功能急剧恶化,预后差。目前已明确抗肾炎的病理改变,主要表现为:肾小球内可见大量细胞浸润、新月体形成、肾小球基底膜不规则增厚和断裂并伴随着尿蛋白、血肌酐和血尿素的上升。

三、实验方法

用不同规格筛网筛取小鼠的GBM,超声波破碎,再用胶原酶消化成可溶性抗原。用适当剂量的抗原免疫兔子,取兔子血清分离纯化抗体。用获得的抗肾小球基底膜抗体经尾静脉注射入小鼠体内,建立抗肾小球抗体肾炎的小鼠模型。通过测定尿蛋白、血肌酐、血尿素等的含量并通过光镜检查及免疫荧光观察小鼠的肾皮质标本确定模型的建立。

四、实验内容

GBM的提取

将 C57BL/6 小鼠用3% 戊巴比妥钠进行麻醉,待小鼠完全进入麻醉状态后,将小鼠腹腔打开,暴露腹主动脉,用生理盐水进行灌流; 取出双肾用 1PBS 溶液(按 100:1 加入蛋白酶抑制剂)清洗,用弯镊去除肾髓质部分,保留肾皮质组分,将肾皮质切成1mm3的小块,用瓶底挤压通过孔径105mu;m(100目,150目,200目)的筛网,同时用PBS(0.01 mol/L, pH7.4,含0.2 g/L叠氮钠)冲洗【3】。再通过孔径125mu;m的筛网后,最终在筛网(孔径65mu;m)上收集肾小球,显微镜下观察肾小管计数小于5%。将分离出的肾小球悬浮于1mol/LNaCl溶液中,置冰浴后行超声(强度18Hz)粉碎,每次约20 s,间隔10mu;s,共10次,再以1 700 r/min, 4℃离心15min,弃上清,沉淀物即为GBM。GBM进一步进行胶原酶消化:按肾皮质干重0.1854 g加8 mg胶原酶,将沉淀物溶解在胶原酶消化缓冲液【4】(50 mmol/LHEPES, 10 mmol/L CaCl2)中, 37℃慢速磁力搅拌20 h后, 10 000 r/min离心30min,弃沉淀,上清即为胶原酶消化后的可溶性GBM粗抗原,BCA测蛋白含量,-20℃保存。【5】

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