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开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字） 1．论文的背景、目的和意义 课题背景： 传统观点认为，细胞的程序性死亡仅有凋亡（Apoptosis）和自噬（Autophagy）两种方式，后生生物通过细胞凋亡清除可能干扰正常功能的损伤或感染细胞，在存活中发挥关键作用。而坏死（Necrosis）则与急性损伤相关，多由病理性原因而产生的被动死亡，并且长期以来被认为是不受调控的过程。但近年的研究表明，细胞也存在调控并主动发生坏死的现象，即“程序性坏死”（Programmed necrosis），或称“坏死性凋亡”（Necroptosis）。程序性坏死已经被证明其有助于各种病理生理条件下的细胞死亡，包括病毒感染，急性肾损伤和心脏缺血/再灌注。 镉（Cadmium/Cd）是一种对生物活性有极强毒性的重金属，即使在低剂量下也能破坏肝脏的稳态。虽然已知肝脏具有在某些条件下再生的能力，但是如果急性暴露于高剂量的化学物质或重金属（如镉）或与低剂量的这些物质反复接触，肝脏可能会严重受损。将细胞暴露在中等水平的镉中96-120 h，会导致细胞丧失膜完整性，并表现出细胞肿胀等一些可能表征细胞程序性坏死的特征，另外，镉也会诱导细胞凋亡，两个过程可能是同时存在的。 异甘草酸镁（Magnesium isoglycyrrhizinate/MgIG）具有异甘草酸镁属最新一代甘草酸制剂，是第四代甘草酸提取物，其具有抗炎，抗纤维化，抗生物氧化，解毒，调节免疫，抑制Ca2 内流，阻止细胞凋亡，稳定细胞膜的作用。对内源性内固 醇的影响等多种功效。临床异甘草酸镁治疗慢性乙型肝炎，酒精性肝，慢性肝纤维化及肝硬化可获得好的疗效。 研究目的： 研究程序性坏死在异甘草酸镁抗镉诱导肝细胞死亡机理中的重要作用及意义。 课题意义： 重金属镉作为有毒重金属污染物易通过污染食物链在人体内蓄积，造成多器官组织损伤，特别是肝脏损伤尤为严重。异甘草酸镁作为临床保肝护肝药物，其明确的分子机制尚不明确。本课题通过从细胞程序性坏死角度出发，探索异甘草酸镁抗重金属镉引起的肝细胞死亡是否与调控程序性坏死途径有关，如果获得证实，则能为异甘草酸镁在预防或治疗重金属引起肝损伤相关疾病的分子机理上提供新思路和理论依据。 2．国内外研究现状（文献综述） 程序性坏死的意义 细胞死亡及其存活是后生动物维持组织稳态的基本特征。早期研究认为，在形态学分类的基础上，细胞通过细胞凋亡，坏死和自噬实现死亡[1]。近年来，越来越多的研究已经描述了坏死的一种遗传编码和调控的形式，称为程序性坏死[2]。程序性坏死是调节细胞死亡的另一种模式，其共同拥有细胞凋亡和坏死的特征：程序性坏死和凋亡都受基因编码调控，但在形态学上，程序性坏死类似于细胞坏死，其通过成团死亡的细胞的存在而区别于细胞凋亡，早期丧失质膜完整性，细胞和细胞器肿胀，细胞质颗粒样变形，染色质片段化和细胞裂解；且与细胞凋亡相反，坏死细胞的细胞内容物通过破坏的细胞膜被动地进入细胞外基质[3]。 已知的是，肿瘤坏死因子-alpha;（Tumor necrosis factor-alpha; /TNF-alpha;）通过RIPK1和RIPK3形成坏死小体（Necrosome）触发程序性坏死， 而TNF受体相关因子2（TNF receptor-associated factor 2/TRAF2）-先前被认为与细胞凋亡抑制相关，现证实也为体外和体内坏死性凋亡的重要生物抑制剂。在建立的成年TRAF2敲除（TRAF2 KO）小鼠模型中，TRAF2 KO会导致过度的程序性坏死，从而引起肝脏坏死小体形成增加，提高了小鼠的发病率和死亡率[4]。这表明程序性坏死可能对肝造成的不良影响不容忽视。 程序性坏死的分子机理 在大多数情况下，细胞死亡是由遗传编码启动的，与其相关的过程通过药理学或遗传学途径干预改变-“受调控的细胞死亡”（Regulated Cell Death/RCD）可以作为生理程序的一部分发生，或者一旦对细胞外或细胞内微环境波动的适应性反应失败就可以被激活[5]。 程序性坏死是RCD的一种形式，其依赖于功能性激酶RIPK3（Receptor-Interacting Serine-threonine Kinase 3）与S345（小鼠）或T357和S358（人类）中假激酶MLKL（Mixed Lineage Kinase domain-Like）的磷酸化[6]。磷酸化的MLKL暴露N-末端的4-螺旋束（4-helix bundle/NB）结构域和中心支撑区[7]，因此形成同源寡聚体并获得结合质膜内叶的磷脂酰肌醇磷酸（phosphatidylinositol phosphate/PIP）的能力[8]。低聚MLKL通过形成孔直接破坏膜双层，使钙或钠流入细胞，是程序性坏死的执行途径[9]。 重金属元素镉对于肝的影响 研究表明，给小鼠饮用水中加入镉（10mg/L）后，通过对肝基因和代谢通路的显著变化的分析，定位于脂质代谢，细胞死亡和线粒体氧化磷酸化的功能途径，这些途径是公认与非酒精性脂肪肝（Non Alcoholic Fatty Liver Disease/NAFLD）相关的；此外，镉处理的小鼠血浆中的肝酶含量较高，肝脏中脂肪堆积的趋势也随之增加[10]。 作为一种广泛存在的环境污染物，镉对细胞具有多重作用，影响细胞分裂，增殖，分化和凋亡等基本细胞过程[11]。在建立的其它几种模型中，表明镉会在体外[12]和体内[13]通过caspase依赖性途径或基于不同镉暴露条件的caspase非依赖性途径诱导细胞凋亡。 另外，在镉诱导人内皮细胞死亡的研究中，除了经典的DNA损伤和线粒体膜去极化等指示细胞凋亡的途径外，还有DNA降解和质膜被破坏的现象被观察到，证明多个死亡信号并行被激活，细胞呈现出涉及到多种不同的细胞器高度调节和复杂的细胞死亡信号传导机制，表明镉诱导的细胞死亡形式有可能是受调控的程序性坏死[14]。 异甘草酸镁的保肝作用 以往的研究表明，MgIG可以减轻由毒素（四氯化碳和D-半乳糖胺）和其他因素引起的肝损伤，包括游离脂肪酸，乙醇和缺血/再灌注[15]。 在奥沙利铂（Oxaliplatin）诱导的肝损伤模型中，MgIG的保护作用被证明与抑制氧化应激，白细胞介素-6途径和凝血系统有关[16]。在环磷酰胺（cyclophosphamide）诱导的肝损伤模型中，MgIG通过NF-kappa;B介导的炎症和PI3K / Akt / mTOR / p70S6K / 4EBP1轴介导的体内和体外自噬改善肝损伤[17]。 另外，异甘草酸镁可以改善化学药物所致的肝损害，使丙氨酸氨基转移酶(ALT)，天冬氨基转移酶(AST)，总胆红素(TBIL)肝功能三项指标明显改善[18]。 3. 论文的理论依据、研究方法、研究内容 研究方法：
研究内容：
4. 研究条件和可能存在的问题 实习所在实验室为省部级重点实验室的科研平台以及细胞与分子生物学实验平台（公共实验室）和动物实验中心等校级科研平台，具备本项目实施所必需的所有材料，在动物及细胞生理学与生物化学、病理生理学等领域均有深入的研究，能够为研究项目提供实验设备和动物饲养等多方面的技术支持。拥有配备先进的分子生物学、细胞培养、免疫技术、基因操作、电泳、生化分析等专门实验室，以及生物学实验中心大型仪器分析测试室。项目所需的大型仪器设备，如全自动凝胶成像仪、实时定量PCR 仪、全自动胶片显影冲洗机、荧光显微镜、大型冷冻离心机、流式细胞分选仪、多功能酶标仪、正置/倒置荧光显微镜、冷冻切片机、生物安全柜等，为完成此本科毕业论文设计提供了完善的基础。 5. 预期的成果和创新点 预期成果：
创新点： 创新性的从程序性坏死角度，探究异甘草酸镁对于有毒重金属镉诱导肝细胞死亡的抑制作用机制。 6．论文撰写的主要内容（论文提纲） 第一部分：文献综述 第二部分：实验研究（包括实验方法、结果等）
第三部分：总结与讨论 7. 论文写作进度安排 三月份：查阅文献及实验技术学习； 四月份：实验研究；
1、观察异甘草酸镁对于镉诱导的肝细胞坏死的影响； 五月份：结果整理以及撰写毕业论文 8．主要参考文献 |
1. Galluzzi, L., et al., Molecular definitions of cell death subroutines: recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death 2012. Cell Death amp; Differentiation, 2011. 19(1): p. 107-120.
2. Vanden Berghe, T., et al., Regulated necrosis: the expanding network of non-apoptotic cell death pathways. Nat Rev Mol Cell Biol, 2014. 15(2): p. 135-47.
3. Vanden Berghe, T., et al., Determination of apoptotic and necrotic cell death in vitro and in vivo. Methods, 2013. 61(2): p. 117-29.
4. Petersen, S.L., et al., TRAF2 is a biologically important necroptosis suppressor. Cell Death Differ, 2015. 22(11): p. 1846-57.
5. Galluzzi, L., et al., Essential versus accessory aspects of cell death: recommendations of the NCCD 2015. Cell Death Differ, 2015. 22(1): p. 58-73.
6. Galluzzi, L., et al., Necroptosis: Mechanisms and Relevance to Disease. Annu Rev Pathol, 2017. 12: p. 103-130.
7. Hildebrand, J.M., et al., Activation of the pseudokinase MLKL unleashes the four-helix bundle domain to induce membrane localization and necroptotic cell death. Proc Natl Acad Sci U S A, 2014. 111(42): p. 15072-7.
8. Murphy, J.M., et al., The pseudokinase MLKL mediates necroptosis via a molecular switch mechanism. Immunity, 2013. 39(3): p. 443-53.
9. Wang, H., et al., Mixed lineage kinase domain-like protein MLKL causes necrotic membrane disruption upon phosphorylation by RIP3. Mol Cell, 2014. 54(1): p. 133-146.
10. Go, Y.M., et al., Low-Dose Cadmium Causes Metabolic and Genetic Dysregulation Associated With Fatty Liver Disease in Mice. Toxicol Sci, 2015. 147(2): p. 524-34.
11. Petanidis, S., M. Hadzopoulou-Cladaras, and A. Salifoglou, Cadmium modulates H-ras expression and caspase-3 apoptotic cell death in breast cancer epithelial MCF-7 cells. J Inorg Biochem, 2013. 121: p. 100-7.
12. Pathak, N., S. Mitra, and S. Khandelwal, Cadmium induces thymocyte apoptosis via caspase-dependent and caspase-independent pathways. J Biochem Mol Toxicol, 2013. 27(3): p. 193-203.
13. Zhang, H., et al., Cadmium-induced oxidative stress and apoptosis in the testes of frog Rana limnocharis. Aquat Toxicol, 2012. 122-123: p. 67-74.
14. Messner, B., et al., Cadmium overkill: autophagy, apoptosis and necrosis signalling in endothelial cells exposed to cadmium. Cell Mol Life Sci, 2016. 73(8): p. 1699-713.
15. Xu, Q., et al., Protective role of magnesium isoglycyrrhizinate in non-alcoholic fatty liver disease and the associated molecular mechanisms. Int J Mol Med, 2016. 38(1): p. 275-82.
16. Zou, X., et al., Magnesium isoglycyrrhizinate has hepatoprotective effects in an oxaliplatininduced model of liver injury. Int J Mol Med, 2018. 42(4): p. 2020-2030.
17. Jiang, W., et al., Magnesium isoglycyrrhizinate shows hepatoprotective effects in a cyclophosphamide-induced model of hepatic injury. Oncotarget, 2017. 8(20): p. 33252-33264.
18. 杨农, 熊., 不同剂量异甘草酸镁治疗化疗药物性肝损害的疗效对比. 2009.
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