亚细胞器分离与代谢组学分析文献综述

 2022-12-22 19:20:31

开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）

  1. 拟解决的问题

外泌体是一种能被大多数细胞分泌的直径为40-100 nm的微小膜泡，具有脂质双层膜结构，且含有细胞特异的蛋白、脂质和核酸，可直接作用于邻近细胞或通过全身循环将其信息传递至远处组织，从而介导细胞之间通讯。肝脏是由多种不同类型细胞（包括肝实质细胞、胆管细胞和星状细胞等）组成的重要器官，各种类肝细胞可通过分泌和摄取外泌体在疾病的发生发展与治疗中发挥作用，如肝细胞来源外泌体可在肝缺血/再灌注损伤后存进肝细胞增殖等。目前，外泌体分离方法多是用于纯化条件培养基和体液（包括脑脊液，血液和尿液）中外泌体，鲜少可用于分离组织间隙中的外泌体。本课题期望基于现有外泌体分离方法，建立一种适用于分离肝组织外泌体的方法，以推动肝外泌体相关研究的进一步发展。

  1. 研究手段

（1）机械破碎法、酶消化法制备肝组织悬液

1、机械破碎法：

用剪刀将肝组织剪成碎片, 放入研磨器内, 加入适量的PBS, 缓慢转动研磨棒, 研磨至匀浆, PBS冲洗研磨器, 收集所得悬液，加入PBS配至最终浓度[1]。

2、酶消化法：

使用刀片在冰上将冰冻的（minus;80℃）人类肝组织（450mg-1g）纵向切片（以提供更大的表面积体积比），切至1-2cm长，2-3mm宽。将一小片（约20mg）放入带有碘化丙啶和磷脂酰丝氨酸的PBS中，匀浆并置于minus;80℃供以后使用。剩余的组织切片称重并转移到含有75U/ml的3型胶原酶的50ml冷冻试管中。然后将组织置于37℃的振荡水浴中培养20分钟。培养5分钟后轻轻地倒置试管，使试管内容物混合，再放回到水浴中培养10分钟，培养结束前使用25 ml吸管轻轻上下吸移两次，然后继续培养。培养结束后立即将组织放回冰中，并添加碘化丙啶和磷脂酰丝氨酸至最终浓度[2]。

（2）超速离心法、聚合物沉淀法分离外泌体

1、超速离心法：

4℃条件下依次以300g，2000g,10000g离心去除不需要的细胞、死亡细胞与细胞碎片等；再以100000g超速离心分离、富集外泌体。然后，用PBS清洗沉淀，去除部分残存蛋白质，最后用适量PBS重悬所得外泌体沉淀[3]。

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