泡沫细胞形成相关基因表达的调节文献综述

 2022-12-07 04:12

1. 文献综述

动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)是一个复杂的病理生理过程，包括LDL氧化修饰、单核/巨噬细胞聚集、泡沫细胞形成、斑块扩大和免疫反应等。其中，巨噬细胞源性泡沫细胞是早期动脉粥样硬化斑块的主要组成和特征。泡沫细胞源于巨噬细胞，是巨噬细胞通过表面的多种受体无限制地摄取氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)颗粒及其他配体，在胞内大量蓄积胆固醇酯和三酰甘油而形成。巨噬细胞通过细胞表面的“清道夫受体”将氧化型低密度脂蛋白摄入细胞中，并转变为泡沫细胞。泡沫细胞在保持巨噬细胞原有功能的基础上，各种细胞功能均发生变化。这一系列功能变化影响AS的形成和发展。研究泡沫细胞，对于寻找动脉粥样硬化的治疗靶点有着重要的意义。

过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferator-activated receptor, PPAR)属于核受体超家族，是一类配体调控的转录因子,目前发现有三种亚型(PPARalpha;、PPARbeta;、PPARgamma;)。其中PPARgamma;被认为是促进脂肪细胞分化与脂肪生成必不可少的基因。同时，PPARgamma;基因也能够维持体内葡萄糖稳态，是Ⅱ型糖尿病治疗药物噻唑烷二酮类药的作用靶点。在脂肪细胞,PPARgamma;与另一个转录因子CCAAT/增强子结合蛋白alpha;(CCAAT enhancer binding protein alpha;, C/EBP alpha;)相互作用、相互配合,诱导脂肪细胞分化及其靶基因(如CD36和aP2)的激活。

清道夫受体是一类跨膜糖蛋白受体，其中SR-A, CD36, LOX-1参与90%氧化型低密度脂蛋白的摄取。PPARgamma;基因也在巨噬细胞中表达。根据已有报道，清道夫受体受到PPARgamma;基因的调控。另外，许多证据提示脂肪细胞和巨噬细胞在生理学方面存在着惊人的互相重叠。脂肪细胞和巨噬细胞的分化均伴随着PPARgamma;的激活。

RNA 干扰（RNAi:RNA interference）是由诺贝尔生理学/医学奖得主 Andrew Z. Fire 和 Craig C. Mello在线虫实验中发现的，2001 年 Elbashir 等人发现哺乳类的 siRNA 可以进行 RNAi 诱导。近年来RNAi干扰技术发展迅速，曾被《自然》杂志评为2002年最重要的科技发明之一。它是指在进化过程中高度保守的、由双链 RNA 诱发的、同源 mRNA 高效特异性降解的现象。由于使用此技术可以特异性剔除或关闭某一特定基因的表达，与常规方法相比更加简便，现在已经成为一种常用的抑制基因功能的方法，也属于研究工具之一，也是目前简单而高效阻断细胞内特定基因表达的最有效技术。该技术已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的基因治疗领域。RNAi 是 21~23bp 的短链双链 RNA（siRNA:small interfering RNA）或者是长链双链 RNA（dsRNA:double-strand RNA），与目的基因表达的 mRNA 同源区进行特异性结合，使 mRNA 降解，达到抑制基因表达的作用。

  1. 课题简介

本课题拟采用siRNA干扰的方法，构建靶向C/EBP alpha;的siRNA载体，进而探究C/EBP alpha;基因对PPARgamma;的作用。首先根据文献或者在线软件工具确定siRNA的模板序列，经公司合成后得到两条单链DNA。经退火操作后，得到一条双链DNA。再以质粒为载体，将其转化入大肠杆菌，培养过夜后抽提质粒。将重组质粒转染RAW细胞，进行Western blot实验，在C/EBP alpha;基因沉默的基础上观察PPARgamma;的表达变化，为进一步探究C/EBP alpha;和PPARgamma;在泡沫细胞形成过程中的相互作用提供理论基础。

  1. 实验方法

3.1 siRNA的合成

根据文献得到siRNA靶序列。再根据siRNA设计原则以及本实验拟采用的质粒载体的结构特点，在两端加上BamHⅠ、Hind Ⅲ酶切位点,中间是9bp茎环结构，并以 6个T作为RNA聚合酶Ⅲ的转录终止子，形成BamHⅠ Sense Loop Antisense 终止信号 Hind Ⅲ的结构。正、反义链送公司合成。

3.2 重组质粒的构建

用灭菌水溶解正义链和反义链，各取适量加入退火缓冲液，退火，得到双链DNA插入片段。siRNA空载体利用BamHⅠ、Hind Ⅲ双酶切，将酶切后的混合物进行琼脂糖凝胶电泳，回收线性载体。取适量siRNA插入片段、线性载体1micro;l、连接酶缓冲液1micro;l、缓冲液1micro;l、无核酶水6micro;l混匀，16℃孵育过夜。将连接产物转化入大肠杆菌，37℃培养过夜后进行质粒抽提，得到重组质粒。

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