CRISPR/Cas9在基因治疗中的应用研究进展
摘要： 基因治疗的目的是纠正或基因突变使用DNA重组技术缺陷。CRISPR-Cas9 提供了一种简便、高效、多样化的基因组编辑方式，在基因治疗中有广阔的应用前景。包括用CRISPR-Cas9技术治疗遗传性疾病、治疗杜氏肌营养不良综合征、对癌症的治疗应用、在治疗病毒感染性疾病方面的应用、与iPS细胞的结合应用等。随着CRISPR-Cas9技术的不断完善，CRISPR-Cas9 技术必将在人类疾病基因治疗中发挥巨大的作用。
关键词：CRISPR/Cas9、基因治疗、疾病应用
基因治疗是指将外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿因基因缺陷和异常引起的疾病，以达到治疗目的[1]。也就是将外源基因通过基因转移技术将其插入病人的适当的受体细胞中，使外源基因制造的产物能治疗某种疾病。从广义说，基因治疗还可包括从DNA水平采取的治疗某些疾病的措施和新技术。基因的激活或抑制，以及基因表达量的多少都影响着细胞的功能和生命体的健康。 而CRISPR-Cas9 是一种新兴的基因编辑系统，它为基因组编辑提供了一种简便、高效、多样化的方式,我们可以通过改造CRISPR/Cas9系统，使失去DNA切割活性的dCas(Dead Cas)以RNA介导靶向多种生物基因组的任何区段，从而实现调控目的基因表达的目的。这使CRISPR/Cas9在基因功能研究、动植物育种等方面都有着广阔的应用前景。CRISPR/Cas9系统现已应用于多种病毒基因的敲除和疾病的基因修复中，在基因治疗方面的研究已经有所报道。本文将对CRISPR/Cas9在基因治疗中的应用进展进行概述。
1.CRISPR/Cas9技术的原理
CRISPR/Cas9系统的工作原理是crRNA(CRISPR-derived RNA)通过碱基配对和tracrRNA （trans-activating RNA）结合形成 tracrRNA/crRNA复合物，这个复合物通过引导核酸酶 Cas9 蛋白在与crRNA配对的序列靶位点剪切双链 DNA（图1）。而通过人工设计这两种 RNA,可以改造形成具有引导作用的sgRNA (singleguide RNA ),这样可以引导 Cas9 对 DNA 的定点切割[2]。
作为一种 RNA 导向的 dsDNA 结合蛋白，Cas9 效应物核酸酶是已知的第一个统一因子（unifying factor），能够共同定位 RNA、DNA 和蛋白，从而拥有巨大的改造潜力。将蛋白与无核酸酶的 Cas9（ Cas9 nuclease-null）融合，并表达适当的 sgRNA ，可靶定任何 dsDNA 序列，而 sgRNA 的末端可连接到目标DNA，不影响 Cas9 的结合。因此，Cas9 能在任何 dsDNA 序列处带来任何融合蛋白及 RNA，这为生物体的研究和改造带来了巨大的潜力[2]。
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