1. 选题的背景和目的
Nrf2即核转录因子红细胞系-2p45（NF-E2）相关因子-2[1]，属于帽和领（Cap n Collar，CNC）转录因子家族成员，是一个由 2.2 kb的碱基对编码的相对分子质量为66000的蛋白[2]，正常情况下，Nrf2可以诱导250多种基因的表达[3]。外界的刺激（如药物、射线）和内源性的活性氧自由基（ROS）会对体内的DNA和蛋白质等造成氧化损伤，如果不及时解除并修复损伤，细胞可能会发生癌变。通过自身代谢的调整来降低细胞的氧化损伤，这种代谢方式主要是借助体内的药物代谢酶（DMEs）如二相解毒酶等结合有害物质，继而将其排除。Nrf2是体内多种二相解毒酶的主要转录激活因子，细胞损伤时Nrf2将通过与抗氧化反应元件（ARE）结合，上调并激活下游二相解毒基因的表达，增强细胞对氧化应激的耐受能力[4]。
白藜芦醇 ( resveratrol，简称 RES ),是一种天然植物药物[5]，化学名称为 3，5，4-三羟基-二苯乙烯 (亦称芪三酚)[6]，因其结构具有多个酚羟基，所以具有较强的抗氧化作用[7]，存在于很多可食用的植物和红酒中[3]。研究显示白藜芦醇可通过激活Nrf2 /ARE通路，正向调控二相解毒酶的表达，清除自由基，改善神经组织氧化损伤状态[8]。
本课题研究白藜芦醇新衍生物对小鼠肺部的影响，通过 Western blot检测Nrf2下游蛋白醌氧化还原酶1（NQO1）、血红素氧合酶-1（HO-1）和谷氨酸-半胱氨酸连接酶催化亚基（GCLC）的表达水平，研究白藜芦醇衍生物是否能激活肺部中的Nrf2-ARE通路，以及该衍生物对Nrf2信号通路的影响，为该药物的临床应用提供新的实验依据。
2. 国内外研究现状
目前认为，Nrf2的活性主要由胞浆蛋白kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1（kelch-like ECH associated-protein 1，keap1）负性调节。keap1富含半胱氨酸，在基础条件下，细胞氧化-还原反应维持内环境的稳定，大部分Nrf2以非活性状态储存于细胞质中，与Keap1相耦联。细胞受到氧化刺激后，Keap1的半胱氨酸残基被修饰，而不能泛素化降解Nrf2[8]，导致Nrf2与Keap1解耦联，Nrf2积累进入核，与Maf结合成异二聚体，识别并结合ARE，启动一系列抗氧化基因和二相解毒酶基因的表达使得DNA免受损伤，对细胞起到保护作用。氧化-还原平衡恢复后，Nrf2与ARE序列解离，转移到胞质，通过Cullin3依赖的E3泛素连接酶进行泛素化后降解，重新维持低水平的Nrf2[4]。Nrf2-ARE 通路是迄今为止发现的最为重要的内源性抗氧化应激通路[9]。研究表明，Nrf2通路在抗肿瘤、抗凋亡、抗炎症反应、抗动脉粥样硬化、神经保护等方面发挥着广泛的细胞保护功能[10]。
人们已将 Nrf2 诱导剂应用于各种体内外实验模型中，发现单功能诱导剂可有效对抗肝脏等器官疾病引起的组织损伤，并验证了其功效在很大程度上依赖于对细胞中Nrf2/ARE通路的激活以及随后对有抗氧化或解毒功能的二相解毒酶系列基因的诱导作用[2]。
研究发现，白藜芦醇可通过多种途径发挥其抗氧化作用，其中之一是促进Nrf2发生核转位，进而活化并诱导二相解毒酶和抗氧化酶的表达[7]。Javkhedkar在自发性高血压大鼠中发现，白藜芦醇能减轻肾脏炎症和损伤，调节抗氧化能力，恢复Nrf2和GST的活性，并减弱高血压的恶化[3]。Enkui Hao在小鼠中发现白藜芦醇能通过Nrf2激活显著减轻LPS诱导的心肌损伤[11]。Rivka Shoulson 在大鼠中发现，白藜芦醇能通过Nrf2保护通路抑制雌二醇诱导的乳腺癌的发生[12]。Shengqin Li等在小鼠中的研究表明，白藜芦醇能上调Nrf2和谷胱甘肽的表达，提高HO-1、过氧化物歧化酶和过氧化氢酶的活性，减少百草枯诱导的氧化应激和肺组织损伤[13]。李淑蓉等发现白藜芦醇能通过抗氧化应激来减弱MPTP 对斑马鱼多巴胺神经元的毒性作用[14]。
3. 实验原理
Western blot是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色，通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中表达情况的信息。丁羟基茴香醚（BHA）是酚醛树脂抗氧化剂，很多啮齿动物的研究表明BHA能通过促进转录而诱导二相解毒酶的表达[15]，因此将BHA作为阳性对照，来研究白藜芦醇（C37）、白藜芦醇衍生物（C32）能否通过诱导Nrf2下游基因的表达，增强细胞的抗氧化能力。
4. 拟采用的试验方法
1) 配药：①C37粉末状-20℃保存，现用时，用无水乙醇配置浓度为100mg/mL，PBS溶液稀释10倍，得到浓度为10mg/mL，最终乙醇的浓度为10%；②取1.000g C32加入10mL无水乙醇得到浓度为100mg/mL的C32溶液，放置于-20℃保存。灌胃时用PBS溶液稀释10倍，得到浓度为10mg/mL的C32溶液用于灌胃，现稀释现用，最终乙醇的浓度为10%；③将无水乙醇用PBS稀释得到10%乙醇。④将BHA粉末溶于玉米油，配置成20mg/mL，混匀，现配现用。
2) 刚到动物房的野生型老鼠养一周后，每只老鼠称重，标记，分为5组，每组两只，连续两天分别灌胃给药C37的乙醇溶液，C32的乙醇溶液，10% alcohol，BHA油溶液，玉米油（给药剂量为：200mg/kg）。
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