1.课题背景及意义
肿瘤干细胞与肿瘤的发生发展往往有着紧密的关系，其自我更新以及多向分化的潜能会引发肿瘤的转移，复发以及耐药等难题，导致癌症进一步恶化。通过放疗、化疗等手段虽然可以对实体瘤起到一定的作用，却难以完全清除肿瘤干细胞，反而引发癌症复发、恶化[1]。故治疗癌症时需要同时清除实体瘤细胞以及肿瘤干细胞，所以联合给药成为现今治疗癌症的一种常见手段。现阶段联合给药面临的困难是如何将几种药物精准富集在病灶部位，提高肿瘤细胞摄取量，以杀伤肿瘤细胞。纳米递送系统是一种高效的药物递送系统，因其经过载药、修饰后具有靶向定位治疗的作用，并且在搭载多种药物的同时可以增加药物之间的协同作用，脂质体杂化纳米粒具有防止药物过早释放，增加药物协同作用的能力，故近年来利用脂质体杂化纳米粒递送药物实现联合给药成为了肿瘤靶向给药的热门研究领域。
本课题通过建立一种共载全反式维甲酸（ATRA）和化疗药物阿霉素（DOX）的脂质-聚合物杂化纳米粒用于干性相关耐药的乳腺癌治疗。所构建的纳米粒的外层为脂质膜，其磷脂双分子层中可负载ATRA；内核为负载DOX的聚乳酸羟基乙酸共聚物（PLGA）纳米粒，当脂质杂化纳米粒到达肿瘤组织后，两种药物先后释放，ATRA促进干样细胞分化为普通肿瘤细胞，DOX杀死实体瘤细胞，两者协同发挥作用；聚乙二醇-聚乳酸共聚物可有效提高药物在体内的循环时间，降低药物的免疫原性，从而提高药效，为联合给药治疗乳腺癌提供可行方案。
2.实验方法
2.1纳米载体材料选择
对于不同种类的纳米载体材料，本实验选择用的药物载体为聚乳酸羟基乙酸共聚物（PLGA）纳米颗粒，PLGA是一种生物可降解的高分子聚合物，经常被用于药物递送系统，制备搭载药物的纳米载体面临着一系列问题，如控制粒径、包封率，对于不同药物，还需要考虑药物制备过程中的溶解性，对于不同设备的可重复性等，对制备的纳米载体还要考虑其被病灶部位的摄取率，吸收速度，载体在体内的免疫原性以及释放药物的效率等。Rebecca L. McCall等比较了单乳液法和双乳液法制备的搭载维生素E的PLGA纳米粒，并测定了其粒径，zeta点位等理化性质，讨论了影响颗粒形成的各种因素并对颗粒设计进行了优化[2]，Hanjie Wang等设计了一种聚乙二醇包被的搭载叶酸的PLGA纳米粒，其结合PLGA与聚合物脂质体的优点，具有持续释放药物的能力，该载体还可以搭载阿霉素，并具有乳腺癌靶向的特点[3]。故本课题拟将抗肿瘤药物阿霉素搭载于PLGA纳米粒上，在制备过程中，首先将药物与载体混溶于有机溶剂中，而后以聚乙烯醇（PVA）水溶液作为稳定剂，在超声作用下将药物与载体的混合溶液加入到聚乙烯醇中乳化，将获得的乳液通过减压蒸发法除去有机溶剂，而后利用透析将残留的有机溶剂除去，即获得搭载阿霉素的PLGA乳液，以备用制备杂化纳米粒。
2.2脂质体与脂质体杂化纳米粒
脂质体在药物递送方面的研究已经有很长一段时间，Doxilreg;作为一种纳米大小的阿霉素脂质体已经在癌症治疗中使用了十几年[4]。脂质体杂化纳米粒近些年在治疗与诊断方面都有许多相关的研究，例如有关脂质体-量子点杂化纳米粒可应用于基于荧光的治疗诊断，磁性脂质体可以对疾病进行定位治疗并减少药物带来的毒性，此外还有多囊脂质体，以及脂质体-高分子多聚物杂化纳米粒子与疾病和检测相关的研究[4]，然而脂质体双分子层内的药物面临着在生物膜以及血浆蛋白处提前释放药物的问题[14]。Yun Hu等考察了脂质体-PLGA杂交纳米粒子的稳定性，并指出杂化纳米粒子的稳定性比PLGA纳米粒子的稳定性高，表面带有较多正电荷的脂质包裹的杂化纳米粒稳定性更高，释放药物能力更好[5]；该团队在后续的研究中还利用超声辅助的方法制备出pH敏感的脂质体-PLGA杂化纳米粒子，其释放速度更加快速[6]。Ping Zou等研究表明将药物负载到PLGA纳米粒再装载到脂质体水相可以有效延长药物释放时间，防止药物过早释放[7]。本课题拟将上述制备的搭载阿霉素的PLGA与搭载ATRA的脂质体制成杂化纳米粒，首先需将磷脂、ATRA与PEG溶解，通过薄膜分散法制备脂质体膜，后将其用载DOX的PLGA乳液水化，并用超声仪分散混匀，将所得乳液透过400纳米的醋酸纤维薄膜，而后利用共挤出作用将PLGA纳米粒包封进脂质体水相，最终获得可以共递送阿霉素与全反式维甲酸的脂质体-PLGA杂化纳米粒。
2.3 实验方法
采用薄膜分散法制备ATRA脂质体。称取一定量天然磷脂、胆固醇与ATRA，加5 mL氯仿溶解。将溶液转移至500 mL茄型瓶中，减压旋蒸除去氯仿，使脂质与胆固醇在茄型瓶底部形成均匀分散的薄膜。随后将茄型瓶转移至真空干燥皿中，继续抽真空12 h除去残余氯仿，使脂质薄膜完全干燥。向茄型瓶中加入3 mL去离子水进行水合，并将茄型瓶放在无真空抽吸的旋转蒸发系统上，水合约30 min。水合产物为浑浊液体，将其转移至7 mL玻璃瓶中，进行探头超声。超声强度为30%，超声时间为5 min，超声后产物为均一分散的脂质体溶液。将脂质体溶液依次挤压通过800 nm、400 nm和220 nm的微孔滤膜，得ATRA脂质体。
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