开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）
- 选题背景及研究概述
恶性肿瘤是当今世界上对人类健康危害最大的疾病之一。据最新调查数据表明，在我国，恶性肿瘤的发病率和死亡率分别占全球的23.7%和30%[1]。因此，对肿瘤的治疗研究也变得愈发重要。当前对于肿瘤的治疗手段主要有三种，手术、化学药物治疗和放射治疗。手术治疗分为根治性手术和姑息性切除术[2]。根治性手术不仅可以改善患者的远期生存率，且具有更高的术后生活质量。但由于肿瘤细胞扩散极快，且并非所有种类的恶性肿瘤都适合切除，因此该方法适用条件苛刻。姑息性切除术术后仍会有肿瘤组织残留，只可改善患者当前的不适，对长期生存无较大延长[3,4]。化疗则是以化学药物来对患者进行治疗，这些药物通常有着一定的毒副作用，会对患者的身体造成损害，降低生活质量。放疗则是通过放射性射线作用于细胞的DNA，使其死亡，同样会对患者的身体造成极大的损害[5]。随着对肿瘤发病机制的不断深入研究，使得临床对恶性肿瘤的治疗方式由手术、化疗和放疗，逐步扩大到在分子水平进行的基因治疗。基因治疗是通过使用生物或非生物的手段，对特定的基因进行激活或抑制来达到治疗目的的一种治疗方法。目前常用的方法有核酶，三链DNA以及本课题中所涉及到的微小干扰RNA（siRNA）等。
近年来兴起的siRNA的基因疗法属于生物治疗的范畴，其通过特异性沉默肿瘤细胞中的一些表达基因，进而达到治疗恶性肿瘤的目的。siRNA可以参与细胞内的RNA干扰（RNAi）途径[6,7]，通过干扰细胞内特定基因序列转录产生的mRNA，来阻止该mRNA的翻译过程，进而抑制该特定基因的正常表达，从而抑制肿瘤细胞的生长发育繁殖。但是在使用siRNA治疗肿瘤的过程中依然存在着一些问题，比如：裸露的siRNA极其不稳定，易被血液中的核酸酶降解，同时由于siRNA分子量大，呈负电荷且具有极强的亲水性[8]，使得siRNA极难直接通过细胞膜来到达起效部位发挥疗效。这些问题限制了siRNA在临床治疗上的应用。因此，设计一种合适的运送载体来进行siRNA的体内递送是很有必要的。
通常情况下，用于siRNA递送的理想载体至少需要满足如下条件：首先该载体能够包载siRNA，在进入体内后能够躲避机体的防御性攻击，能够从血液循环渗漏到肿瘤部位，在肿瘤细胞的细胞质中释放所运载的siRNA[9]。当前siRNA的载体主要分为两大类：病毒载体和非病毒载体[10]。其中病毒载体具有较高的转染效率的优点，但是其特异性较差，封装能力不足，同时会带来生物安全性的问题，这些限制了病毒载体在临床治疗上的应用。非病毒载体主要包括阳离子脂质及脂质复合物，有阳离子聚合物和无机纳米材料，其具有运载量大，易于修饰，方便保存以及安全性高的优点。阳离子脂质体具有制备简单，可重复转染和易降解的特点[11]。同时，阳离子脂质体具有更低的毒性，对人体的正常组织细胞有更小的损害。
临床研究表明，由于肿瘤细胞生长快于正常细胞，因此血管供应的氧气和养料无法跟上其快速扩增，导致肿瘤细胞长期生存在缺氧环境中，因而较正常组织细胞产生更多的乳酸的酸性代谢产物，所以肿瘤细胞的pH低于生物体内的正常组织细胞，为提高载体向肿瘤部位的靶向效率，通过一种pH敏感的磷酸钙（CaP）纳米颗粒来运载siRNA，由于磷酸钙纳米颗粒具有pH敏感，可以在弱酸条件下迅速溶解，而后释放出药物[12]，因此可以通过核心在不同pH部位的释放效果不同来达到siRNA在肿瘤细胞内的富集，从而抑制肿瘤细胞的生长 [13]。
本课题拟构建一种具pH敏感内核的阳离子脂质体用于阿霉素的递送。阿霉素是一种抗瘤谱广泛的抗肿瘤抗生素，对多种肿瘤具有良好的治疗效果。它可以抑制DNA和RNA的合成，其中对RNA的抑制作用最强，属于周期非特异性药物，对各个时期的肿瘤细胞都有杀灭作用，多与其他抗癌药联用。但是阿霉素在治疗肿瘤细胞的同时亦会对生物体产生广泛的生物化学作用，具有严重的细胞毒性作用，进而引发多种毒副作用，例如心脏毒性及白细胞和血小板减少等。使用脂质体作为该药物的靶向递送载体可以提高药物的稳定性，改善药物的释放行为，同时减少药物在体内敏感部位，如心脏中的聚积，以此来减轻药物的毒副作用。此外药物靶向肿瘤部位后，还可以减少药物的摄入，增加药物的治疗指数，进而减轻毒副作用。
- 预期目标
本课题拟构建一种具酸敏感内核的共载阿霉素阳离子脂质体靶向递药系统，期望其能靶向肿瘤细胞，实现药物在肿瘤细胞处的富集。由于肿瘤细胞pH低于正常组织细胞，载有siRNA的酸敏感核心响应肿瘤部位的pH后降解，释放siRNA。用粒径，zeta电位，电镜，包封率，载药量，药物体外释放行为等作为评价指标，筛选出最佳处方。要达到的目的具体如下：
- 制备一种具酸敏感内核的共载阿霉素阳离子脂质体；
- 确定简单有效的阳离子脂质体和酸敏感纳米粒子的制备处方；
- 对该脂质体进行表征；
- 体外考察该脂质体的酸敏感性；
- 评价该脂质体的体外药物释放行为。
- 研究手段
（一）实验原理
1.1 CaP纳米粒子的制备
本课题计划使用油包水微乳化方法制备CaP纳米粒子[9]。将乳化剂加入到油相中，不停搅拌，边搅拌边加入水相，即可得到W/O型乳剂。水相包含有siRNA以及CaCl2和Na2HPO4,即可得到所需的CaP核心。由于该核心不溶于无水乙醇，因此可使用无水乙醇洗去多余的有机溶剂。
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