开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）
研究背景：肿瘤血管系统的形成和生长, 依赖于血管内皮生长因子 (vascular endothelial growth factor, VEGF) 。贝伐珠单抗 (bevacizumab, Avastin) 是一种重组人源化免疫球蛋白G1 (Ig G1) 单克隆抗体, 可以结合VEGF-A, 抑制其与VEGF受体 -2 (VEGFR-2) 结合, 继而抑制VEGF的生物学作用, 包括影响血管的渗透性、增生以及内皮细胞迁移与存活, 达到抑制肿瘤血管生成、 生长以及转移的效果此外, 贝伐珠单抗的一些其他可能的作用机制也正在被广泛研究。与单独给药相比, 贝伐珠单抗与化疗药物联用可提高抗肿瘤疗效, 这可能得益于贝伐珠单抗可减小肿瘤内组织间隙的压力, 从而增强化疗药物在肿瘤内部的渗透作用。目前在全球范围内, 贝伐珠单抗已经被广泛用于结直肠癌、肺癌、卵巢癌、宫颈癌、 胶质母细胞瘤等多种肿瘤的治疗。
课题简介及研究的目的和意义：单克隆抗体在大规模生产中主要分为细胞培养、分离纯化和制成制剂三个阶段。在细胞培养过程中产生了多种杂质，使其在制成制剂前需要进行分离纯化，才能投入市场。但是，抗体的细胞表达水平随着抗体工程技术的发展得到了显著提高，大大降低了规模化细胞培养的成本。因此，在大批量生产中，纯化成为了抗体药物生产的关键。本课题旨在对CHO细胞表达的贝伐珠单抗的细胞收获液通过亲和层析、阴离子交换层析和阳离子交换层析工艺的研究，最终获得高纯度的贝伐珠单抗。
研究内容及研究方法：（1）样品初分离:临床前中试工艺中使用ALFA LAVAL的LAPX404连续流离心机进行固液分离，上清液通过0.65um的过滤器澄清过滤。由于连续流离心机分离效率不够理想，残留的大量细胞碎片可穿过过滤器，导致料液浊度大于100NTU。经超滤浓缩后料液浊度急剧上升，直接上株从理论上将影响层析填料的寿命以及降低纯化效果。中试工艺中使用过两次深层过滤，一次为在连续流离心之后，料液用1块1.1m2的XOHC (MDOHC10FS1, Millipore公司)进行分离;另一次直接使用深层过滤分离，膜包为2块1. 1m2 DOHC (MDOHC l OFS 1)串联1块1. 1m2 XOHC，均为Millipore公司产品。（2）超滤浓缩及缓冲液置换：临床前中试工艺中使用2块2.5m2的Biomax聚醚矾超滤膜(Millipore公司，截留分子量为50kD)将细胞培养上清液超滤浓缩至放罐体积的5一10%，再用2. 0一4. 0倍浓缩液体积的置换缓冲液1(20 mmol PB 0. 15M NaCl, pH7. 2进行置换。（3）Mabselect Sure亲和层析:ProteinA的层析介质是大规模单克隆抗体捕获工艺的业界标准，深层过滤后培养上清上样至亲和层析柱，确定临床前中试生产亲和层析的方案。（4）低pH孵放法灭活病毒:亲和层析洗脱收集样品的pH值约为4. 2，因此考虑洗脱后采用低pH孵放法进行病毒的灭活处理。根据Henry C.等人的方法，IgG1类抗体灭活病毒采用的低pH值为3. 5。具体操作如下: 1. 5--2. 5倍冷却注射用水稀释亲和层析洗脱收集的样品，2M柠檬酸调节pH值至3. 5, pH可接受范围3.4--3.6, 18260C下孵放2h，完成病毒的灭活;2M Tris-HCl(pHB. 0)调节蛋白溶液pH值至7. 15--7. 25，以满足下一步层析的需要。（5）Q-FF阴离子交换层析：在单克隆抗体及其片段的分离纯化中，离子交换层析由于其价格相对便宜，使用寿命长，分离条件温和，选择范围广，耐受强酸碱的处理而被广泛应用。样品进一步上样至阴离子交换层析柱，采取流穿的方式收集抗体，最后用高盐和强碱去除吸附在介质上的内毒素和核酸。（6）阳离子交换层析：单克隆抗体纯化过程中，阳离子交换层析常与阴离子交换层析串联使用。采用阳离子交换层析的结合一洗脱方式进行最后的精细纯化，确定中试生产层析方案。阳离子交换层析pH值的研究： 对于离子交换层析，抗体与层析填料的结合能力随pH改变而不同，因此pH值的选择至关重要。我们选择pH5.2, 6.0, 6.5, 7.0四个不同的pH值条件，通过考察载
量、纯度及收率确定最佳pH值。层析柱为HiTrap SP FF lml预装柱(GE公司)，流速lml/min, 0--100%B液进行线性洗脱25倍柱体积。洗脱液盐浓度的研究：为确定最佳的洗脱盐浓度，我们选择16%B, 17%B, 18%B, 19%B, 20%B五种洗脱液进行研究。层析柱为HiTrap SP FF 5 ml预装柱(GE公司)，缓冲液A (20mM CH3COONa, pHS. 2平衡层析柱后，3ml/min流速上样，缓冲液A洗去未与层析柱结合的杂质，分别用五种不同的缓冲液进行洗脱，考察洗脱组分的纯度及收率。（7）纳滤法除病毒过滤：为进一步降低病毒污染风险，我们在工艺中加入了纳滤膜除病毒过滤步骤。通过缩小规模实验评估了串联Viresolve Prefilter(除病毒专用预过滤膜VPF)和Viresolve Pro(除病毒纳滤膜VPro)对料液的除病毒过滤效果。（8）纯化工艺的放大： 纯化工艺的放大原则为层析过程中线性流速不变，柱床高度不变。根据批蛋白总量及填料载量计算所需要的填料体积，选择适当规模的层析柱。
参考文献：
[1]胡春艳,刘全忠.单克隆抗体制备技术及应用的研究进展[J].安徽预防医学杂志.2008,14（3 ）：116-118.
[2]王军志主编.生物技术药物研究开发和质量控制[j].科学出版社, 2007 年 10 月 97，779.
[3] Meeting the Challenges in Manufacturing, Formulation, Delivery and Stability of Final Drug Product. Steven J. Shire,2015,96(1):45-81.
[4] Henry C. Vogel Chapel Hill, WC:Fermentation and biochemical engineering handbook-Elsevier Science ISBN: 978-1-4557-2553-3 2014.06.
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