- 课题背景
p53作为一种重要的抑癌基因，在50%以上的人类癌症中发生了突变[1]，研究表明，p53蛋白在使细胞周期停滞和对急性DNA损伤信号的凋亡反应中发挥着重要作用，这对于抑制肿瘤是必不可少的。[2]由TP53基因编码的p53蛋白具有不同的亚型，主要包括存留 N 末端转录激活域（NAD）的TA蛋白亚型和缺失 NAD的 DN 蛋白亚型。两种亚型在结构上均包括中间的DNA结合域（DBD）和C末端的寡聚域（OD）[3]。各结构域作用各异， 其中NAD能够吸引多种调节子决定p53功能的开启与关闭，DBD 主要与多种p53反应元件结合，OD则负责将 p53蛋白单体聚合成四聚体进而发挥作用。[4]通过对来自p53 C末端区域的许多肽对细胞生长的抑制作用以及对各种肿瘤细胞凋亡的诱导作用进行研究，发现p53的361-382片段（p46）在诱导细胞凋亡中发挥着最重要的作用[5]。研究表明，p46可以激活p53功能的有利构象改变，[6] 并且恢复活细胞内一些突变型p53蛋白的转录反式激活功能，诱导表达p53的肿瘤细胞发生凋亡。
近年来，由于p53在抗肿瘤上表现出的良好效果，与其相关的实验研究数量已得到明显提升。研究表明，基于基因工程将p53基因导入载体并使相关蛋白在肿瘤细胞中表达的方法已经产生了多种临床肿瘤治疗方案, 例如针对胃癌、肺癌、肝癌、乳腺癌等多种肿瘤的研究治疗手段[7]，并且在多个国家和地区得到成功应用,与此同时在一些晚期肿瘤的治疗过程中[8]，p53基因还具备其独特优势。[9]
与此同时，随着生物制药技术的迅速发展，蛋白质类药物的研发已成为其不可缺少的一部分。而融合蛋白药物与传统的蛋白质药物相比，不仅保留了原有蛋白的生物学活性，而且经过融合，其分子量得到扩增，从而不易被肾小球滤过，具有延长药物半衰期的作用。[10]
抗体片段由于其相对较小的尺寸和其他独特特性而逐渐成为有前途的生物制药产品，与全尺寸抗体相比，这些抗体片段缺乏结合新生儿Fc受体（FcRn）的能力，并且半衰期缩短。因此Fc工程结合抗原，但保留与FcRn和与单体蛋白融合的Fc的相互作用，目前正被开发为半衰期延长的候选治疗药物。[11]例如一些Fc融合蛋白具有类似单抗的功效，Fc融合蛋白技术可以通过合理的蛋白结构设计药学性质，再辅以糖基化修饰技术以及新剂型的开发可以使药物获得更长的半衰期，具有广阔的应用前景。[12]
研究表明，IgG1 Fc与新生儿Fc受体（FcRn）的相互作用在维持其长半衰期中起关键作用。经突变改造后得到的可溶性单体IgG1 CH3（mCH3）与野生型二聚体CH3相比，mCH3表现出与FcRn类似的pH依赖性结合并显示出了更好的延长药物半衰期的潜力。[11]因此mCH3不仅可以帮助探索CH3对Fc功能（二聚化和FcRn相互作用）的双重作用机制，而且可用于开发具有最佳半衰期、组织穿透性与可及性的候选疗法，提高治疗效果。[13]
考虑到p46与mCH3各自的优越性，在本课题中，我们将人细胞肿瘤抗原p53的361-382片段（即p46）与mCH3融合表达，通过基因工程的方法，转入大肠杆菌原核表达系统进行诱导表达，然后分离纯化得到目标融合肽p46-mCH3，研究该新型融合肽的抗肿瘤效果，评估mCH3对多肽抗肿瘤活性的影响，为新型抗肿瘤多肽的研发奠定基础。
- 实验目的和意义
本实验中我们分别构建P46-mCH3和mCH3质粒载体，导入大肠杆菌中诱导表达，并分离纯化得到P46-mCH3和mCH3，优化诱导表达以及分离纯化的条件，以期得到稳定高效的多肽制备工艺，为进一步研究其抗肿瘤作用奠定基础。对P46-mCH3功能及分子机制的深入研究有助于其在肿瘤治疗方面的应用，提供全新的研究视角，为更多的肿瘤患者带来新的希望。
- 实验内容
本课题内容可分为以下三个部分：
1.P46-mCH3和mCH3在大肠杆菌中的表达
合成P46-mCH3和mCH3序列，构建相应表达载体,并导入大肠杆菌中表达。设计探索蛋白表达的最佳条件，包括诱导剂浓度和诱导时间，通过SDS-PAGE检测目的蛋白的表达情况，筛选出诱导表达的最优条件，并在此条件下进行大规模培养。
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