外消旋化修饰对过氧化物还原蛋白Prx2功能的影响研究文献综述

 2022-12-25 12:13:17

开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）

  1. 课题背景

过氧化物还原酶（peroxiredoxins，Prxs），一类结构高度保守的抗氧化蛋白超家族，广泛存在于真核以及原核生物中。在哺乳动物中，有六个Prxs亚型（prx1-6），分为典型2-Cys（Prx-1到 Prx-4），非典型2-Cys（Prx-5）和1-Cys（Prx-6）三个亚族。其主要生理功能是保护细胞免受过氧环境的损伤。其中Cys52 是其活性位点，在发生氧化反应时，其脱氢氧化形成二硫键。在过氧化物存在的条件下，除了上述反应之外，还会使得氨基酸发生外消旋化。

除甘氨酸外，所有常见的氨基酸都具有手性中心，因此导致L和d型氨基酸的出现。相比于D型对映体，L型对映体是自然界中必不可少的分子，其基本作用是作为蛋白质成分和代谢过程和细胞-细胞信号转导的中间体。对于D- 氨基酸的来源，目前理论界普遍认为是由L- 氨基酸的外消旋化产生的。这种外消旋化被认为是一种蛋白质翻译后修饰(post-translationalmodification，PTM) 类型。产生外消旋化的氨基酸有天冬氨酸、谷氨酸和丝氨酸等，其中天冬氨酸的外消旋化较为普遍。蛋白质中氨基酸的这种外消旋化会对其功能和空间结构产生一定程度的影响，它与某些疾病的相关性已被研究证实。近年来，体内、体外实验发现，蛋白质中氨基酸发生外消旋化受到自由基、pH、酶和温度等多种因素的影响。

目前，蛋白质中氨基酸外消旋化检测的难点主要由于 D-氨基酸与 L-氨基酸分子量完全一致，蛋白质组学分析中常用的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱( MADLI-TOF-MS) 、液相色谱-质谱联用技术( LC-MS) 等方法都无法测定。近年来，关于蛋白质中氨基酸外消旋化程度及外消旋化位点评价方法的研究和应用众多，主要包括蛋白质酸水解后氨基酸的测定、蛋白质酶水解后肽段的测定以及蛋白质和多肽的免疫学测定。这些方法主要问题在于（1）酸水解过程通常在高温环境（100℃左右）中进行，处理一定时间则会引起蛋白质中氨基酸额外发生外消旋化，衍生化过程也可能导致外消旋化的发生，使测定结果略有偏差；（2）只能用于D-氨基酸总量测定，无法进一步确定D-氨基酸外消旋化修饰位点，特别是蛋白质活性中心、功能相关区域的外消旋化修饰程度无法评价；（3）需用纯化后的蛋白测定，生物样本纯化提取蛋白工作量较大。目前常用的外消旋化测定方法是分离目标蛋白质后，将目标蛋白经过传统的酸水解处理成游离氨基酸，然后手性衍生试剂柱前衍生HPLC法或手性HPLC法测定D/L-氨基酸比例并计算蛋白质中氨基酸的外消旋化程度。

前期研究发现，Prx活性中心的肽段PLD46FTFVC52在体外模拟过氧化物环境中可迅速发生Asp46的（天冬氨酸）外消旋化，24小时内其外消旋化修饰超过12%。因此，建立合适的外消旋化修饰的方法，有利于我们后续探究氨基酸外消旋化对其正常功能的影响以及与疾病之间的联系。

  1. 要解决的问题
  2. 建立合适的提取纯化Prx-2的方法；
  3. 建立简便易行的蛋白质外消旋化位点及外消旋化程度评价方法；
  4. 可行性分析

课题已有一定的文献调研以及实验摸索基础，而且实验室的现有仪器足以满足课题的进行，为实验的实施提供了保障。

  1. 研究方法和内容
  2. Prx-2的提取纯化

取大鼠抗凝全血，高速离心后弃去血浆上层，RBC洗涤、裂解，提取出红细胞中蛋白，倒于培养皿上，放入冻干机中冷冻干燥。将红细胞胞内蛋白经过阴离子交换层析分离，纯化。

  1. Prx-2胶上酶解LCMS法

通过建立体外氧化模型，对Prx-2进行氧化，在不同时间点取出氧化后的血样进行后处理，之后进行蛋白浓度的测定、H2O2浓度的测定以及非还原型和还原性血样蛋白的电泳；进行切胶，通过比对对照品maker的条带，判断出蛋白的单体和二聚体，取出单体和二聚体条带；对蛋白进行还原烷基化之后选择合适的酶进行酶解，最后进行LCMS测定Prx2二聚体和单体中外消旋化修饰程度差异，并评价外消旋化修饰对Prx2二聚的影响。

  1. 工作计划

2月25日—3月4日：实验准备阶段：确定课题，查找相关文献资料，设计实验过程。

3月5日—3月26日：实验前期阶段：Prx-2的提取纯化的分析方法研究。

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