一种中药稳定内参基因的筛选文献综述

 2022-12-25 11:42:51
  1. 拟解决的问题

补骨脂是一种蔷薇目，豆科一年生草本植物。其果实干燥后可入药，有补肾壮阳、固精缩尿、温脾止泻的功效。其主要成分为补骨脂素，具有抗癌、止血、支气管平滑肌舒张等药理作用。在补骨脂素的生物合成研究中，常使用定量反转录聚合酶链反应技术（qRT-PCR）测定基因表达水平，而该技术需要稳定的内参基因作为定量分析的参考。而目前尚未有可供补骨脂研究使用的内参基因。本课题的目的在于筛选出补骨脂中稳定、可靠的内参基因，为qRT-PCR实验提供参考。

  1. 实验目的
  2. 熟悉并掌握PCR、RT-PCR、qPCR、DNA提取、目的基因导入质粒、质粒提取等技术的原理和操作。
  3. 熟悉BestKeeper、NormFinder和geNorm三个分析软件的使用。
  4. 筛选出补骨脂中稳定的内参基因。
  5. 实验方案

本实验拟采用PCR及其衍生技术对补骨脂中的候选内参基因进行扩增分析，再使用BestKeeper、NormFinder和geNorm等分析方法对扩增结果进行分析比对，从而选出较稳定的内参基因并优化最佳基因数量。接着用候选内参基因来计算某一定量表达的基因的相对表达水平，从而进一步验证候选内参基因的稳定性。

  1. 实验方法
  2. 植物预处理

将新鲜存活的植物置于特定的实验条件下培养一段时间，并进行一定数量的重复试验。

  1. 基因选择和引物设计

根据查阅的文献资料或转录组数据选择表达较稳定的基因作为候选基因，用于不同实验条件下稳定内参基因的筛选。

  1. 总RNA、DNA提取和cDNA合成

总RNA、DNA提取和cDNA合成均按照试剂盒的使用说明进行。

  1. RT-PCR和qPCR分析

将上一步的提取物用酶处理，去除基因组DNA。配制反转录体系，按一定条件进行PCR反应。cDNA稀释一定倍数后用于qPCR分析。若分析结果显示引物特异性好，则可以结束分析，否则需要重新设计引物。

  1. 基因表达稳定性分析

在取得良好的实验数据之后，用三个基于Excel的软件：BestKeeper、geNorm、和NormFinder进行分析筛选，并对结果进行比对分析，最后筛选出不同实验条件下的稳定内参基因。

  1. 流程安排

3月4日-3月10日：查看任务书，撰写开题报告

3月11日-3月20日：查阅文献和相关资料，补充并完善实验具体步骤

3月21日-4月15日：进行实验

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