开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）
一、课题背景
肝脏不但是人体的主要代谢器官，也是重要的防御器官。从各种途径进入体内的外源性化合物和人体产生的有毒代谢物无论是在肝内转化，亦或是潴留都容易引起肝损伤。
目前肝损伤模型尤以人正常来源L-02细胞最为常见，此外也还有同时应用肝癌细胞株HepG2及L-02细胞株的方案。尽管某些药物代谢酶的表达较低，L-02细胞一直被认为是有价值的细胞模型，并常用于毒性化合物的风险评估。相较于L-02细胞株，新鲜分离的原代肝细胞CYP 酶的活性很高。作为体外模型中评估药物代谢和毒性的黄金标准，它们保持着绝大部分的原有构造和体内功能。而其他CYP酶活性过低的细胞，表型和功能更接近胚胎肝细胞而不是成体肝细胞，与原代肝细胞的水平差距明显。这意味着在研究肝损伤时，在考虑到能否较好地反应该药物的药理效应的基础上，对细胞模型的选择是一个重要的问题。
卡马西平是一种经常被用于治疗癫痫的药物，它口服后被缓慢吸收，据报道其生物利用度为75-85%。卡马西平的血浆蛋白结合率达到70-80%，在肝脏中几乎全部通过环氧化和羟基化反应进行代谢。这种药物在体内主要被CYP3A4、CYP3A5和CYP2C8酶代谢为CBZ-10、11-环氧化物，该反应性代谢物具有很强的药理活性，且由于能够形成共价蛋白结合物而具有潜在毒性。卡马西平引起的严重肝损伤反应通常是自限性的，典型症状包括发烧、恶心、全身不适和在给药中止后的一段时间内出现的右疑病症疼痛。其肝损伤后果非常严重，可能导致因急性肝衰竭而进行肝移植甚至死亡。研究如何正确预防和管理如卡马西平类经肝脏代谢的抗癫痫药物引起的不良反应，对于实现更有效和更安全的癫痫治疗具有临床意义。由于药物在不同CYP酶表达水平的细胞中表现出不同的细胞毒性，在药物代谢研究、药物相互作用和酶诱导方面，不同来源的肝细胞可能会呈现差异性药效，对于不同细胞模型的作用效果比较值得深入探讨。
- 要解决的问题
卡马西平引起的严重肝损伤被归类为特殊的药物性肝损伤，其诱导的肝损伤患者的死亡率高达20%左右，而肝损伤在发作前的服药过程中无法预测。使用其他辅助用药减轻卡马西平导致的肝损伤，有助于保证用药的风险-效益平衡性，对于卡马西平在治疗癫痫时的长期应用、改善维持性用药患者的远期疗效，减轻并发症，有着重要的临床意义。我们采用原代肝细胞和L-02细胞作为给药对象，探讨水飞蓟宾与卡马西平联用时对肝细胞保护作用的效果，以及在不同种类肝细胞上实验的效果差异。
- 可行性分析
水飞蓟宾具有优良的肝脏保护作用及缓解氧化应激的功能，我们尝试将水飞蓟宾与卡马西平合用，观察肝细胞所受影响，判断水飞蓟宾能否保护暴露于卡马西平诱导损伤作用下的肝细胞。MTT比色法是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲臜并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜能溶解细胞中的甲臜，用酶联免疫检测仪在570nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。该方法经济、灵敏度高，已广泛用于一些细胞毒性试验，利用该方法，能够在建立细胞损伤模型时选择合适的给药浓度。
- 研究方法和内容
1.原代肝细胞提取及培养
采用改良的两步灌流法提取鼠原代肝细胞。将过滤得到的肝细胞悬液体积均等地分置于2~4个10ml离心管中，在500rpm、5min的条件下离心三次。离心后倒去上清液，吸取培养基小心重悬离心管壁上的细胞。取体积分别为180micro;l和20micro;l的新鲜肝细胞悬液与0.4%的台盼蓝溶液混合，染色3-5min。后将血球计数板擦拭干净，吸取混合液滴于板上，打开倒置相差显微镜，观察计数。
用加有10%胎牛血清和双抗的培养基调整细胞母液的密度，将密度适宜的细胞以每孔2ml的体积接种于6孔培养板，以每孔100micro;l的体积接种于96孔培养板。在37℃，5%CO2的培养条件下培养。4小时后细胞即贴壁，可进行第一次换液，之后每24小时更换一次培养液。
