不依赖辅酶的脱羧酶/加氧酶级联有效合成香草醛
香草醛是世界上最广泛使用的风味化合物之一，也是一个有希望的多功能构建块。 用植物来源的阿魏酸生产香草醛的生物技术生产作为化学合成的新替代品已经引起了广泛的关注。 已知的代谢途径对香草醛的一个限制是其对昂贵的辅酶的需求。 在这里，我们开发了一种从阿魏酸生成香草醛的新途径，不需要任何辅酶。 该人工途径由不依赖辅酶的脱羧酶和辅酶辅助加氧酶组成。 当携带脱羧酶/加氧酶级联的大肠杆菌细胞与阿魏酸一起培养时，细胞通过4-乙烯基愈创木酚在一起有效地合成了香草醛（8.0mm，1.2gL -1），而没有产生任何可检测到的芳族副产物。 这里描述的有效方法可能适用于植物来源的其他高价值化学物质的合成。
介绍
香草醛（4-羟基-3-甲氧基苯甲醛）是食品和化妆品中世界上最重要的风味和香料化合物之一，也用作药物合成中的中间体。[1]此外，香草醛是制备官能化聚合物的有前途的结构单元[2]大部分香草醛生产（约12000吨/年）目前取决于化学合成，包括乙醛法和硝基法。[1b，3]在这些方法中，香草醛通过将甲酰基引入到芳香环。然而，这些化学方法并不完全避免使用有毒的再剂或产生有害副产物。[3]近年来，环境友好的化学方法也得到了广泛的研究。[3，4]天然香兰素来自香草兰的豆类，但从植物来源提取的香草醛的量是有限的，少于1％的香草醛生产来自天然来源。
生物催化生产作为传统方法的绿色替代品已经引起了广泛的关注[5] 阿魏酸（4-羟基-3-甲氧基肉桂酸）是生物技术生产香草醛的实际起始原料，因为该化合物可从可再生资源获得。[6] 例如，可以从农业工业废弃物（例如，从谷物麸皮）中回收大量的阿魏酸。[6] 使用天然阿魏酸作为原料的生物技术过程提供香草醛作为合成各种化学物质的“生物基结构单元”。[1,2]此外，在欧洲和美国的立法之下，通过生物技术生产的香草醛可以被标记为“天然风味” ; 这与合成风味相比是非常昂贵的。
已经分离出许多将阿魏酸转化为香草醛的微生物[5]例如，生长的放线菌细胞从阿魏酸产生10-20克L 1香草醛[5]虽然这些微生物对生物技术生产香草醛具有很大的潜力，但它们通常包括香草醛降解途径，这导致不希望的副产物和低产物产量。[7,8]因此，有几名研究人员试图将埃希氏菌以表达在香草醛合成中的基因，因为该模型微生物没有香草醛降解途径，并且因为它允许异源基因的高水平表达。两种基因可用于从阿魏酸合成香草醛（方案1A）。[7]一个编码阿魏酰辅酶A合成酶（Fcs），其催化阿魏酸向阿魏酰辅酶A的转化。另一种编码烯酰辅酶A水合酶/醛缩酶（Ech），其催化阿魏酰辅酶A向香草醛的转化;表达这两个基因的大肠杆菌细胞能够通过阿魏酰辅酶A从阿魏酸合成香草醛。[9]然而，Fcs需要ATP和CoA作为辅酶的事实（方案1A）使得该生物技术过程复杂化，因为这些昂贵的辅酶必须连续地供应给Fcs以实现高产量生产香草醛。最近，Lee等人试图通过在大肠杆菌中构建CoA再生系统来提高生产力。[10]如果辅酶依赖性途径可以用不依赖辅酶的途径代替，则生物催化过程不需要构建辅酶再生系统或添加辅酶或能源（例如葡萄糖）。
在本研究中，我们设计了一种不含阿维酸的香草醛途径。 该人工途径由将阿魏酸转化为4-乙烯基愈创木酚（2-甲氧基-4-乙烯基苯酚），然后将不饱和单体加氧酶转化成4-乙烯基愈创木酚至香草醛（Scheme 1 B）。 脱羧酶已被很好地研究[11]，但是没有报道第二反应的合适的酶。 我们通过使用基因组挖掘方法搜索第二步酶，并发现了一种新型的辅酶辅助酶，其切割4-乙烯基愈创木酚的C = Cbond以提供香草醛。 然后，我们在大肠杆菌中构建了辅酶独立的两步代谢途径，并研究脱羧酶/加氧酶催化合成香草醛。
全基因组搜索新型辅酶辅因子基因
为了通过4-乙烯基愈创木酚（方案1B）从阿魏酸制备香草醛的辅酶途径（方案1B），我们首先搜索了一种可以在不存在任何辅酶的情况下通过使用基因组开采将4-乙烯愈创木酚转化成香草醛的第二步酶做法。类胡萝卜素裂解氧酶家族的酶是这种活性的候选物。这些酶将铁作为假体基团，催化有机分子的共轭C = C键的氧化裂解，而不需要任何辅酶。该酶的氧化还具有相当于化学臭氧分解的高催化潜力.Yamada et人。报道说，Iso是来自恶臭假单胞菌IE27的这种家族的加氧酶，以辅酶不依赖的方式将异丁子香酚转化为香草醛。然而，其与4-乙烯愈创木酚的活性较低（与异丙醇相比为1％）。没有报告这个氧气家庭的成员有效地将4-乙烯愈创木酚转化为香草醛。因此，搜索细菌基因组序列编码辅酶辅助加氧酶的基因。使用Iso的氨基酸序列进行基因组序列的BLAST搜索（支持信息中的表S1）。来自硝基假单胞菌的异丁香酚加氧酶Jin1与Iso（82％）表现出最高的氨基酸相似性，其次是几种推定的类胡萝卜素裂解加氧酶（〜40％相似性）。有趣的是，细菌隐球菌ATCC 21756的基因组序列含有三个推定的类胡萝卜素氧基基因Cseg_1716，Cseg_1740和Cseg_1745，其基因产物与Iso具有中等氨基酸同一性（42％）（E值8e-118,3e-125和3e-120;图S1）。 Cseg_1716的基因产物分别与Cseg_1740和Cseg_1745分别具有46和38％的氨基酸同一性; Cseg_1740的基因产品与Cseg_1745的基因产品共42％。这三个推定的基因产物显示不同的氨基酸序列，并且是4-乙烯基愈创木酚氧化的候选者。在这项研究中，我们专注于C. segnis的完全类胡萝卜素加氧酶补体。 ORFs Cseg_1716，Cseg_1740和Cseg_1745分别被指定为cso1，cso2和cso3。
以上是毕业论文文献综述，课题毕业论文、任务书、外文翻译、程序设计、图纸设计等资料可联系客服协助查找。
