静息培养法与生长细胞转化法在双羟化去氢表雄酮中工艺的比较
背景介绍
甾体激素类药物是指分子中含有甾体结构的激素类药物，具有较强的抗感染、抗过敏、抗病毒、抗休克等药理作用[1-2]，是临床上一类重要的药物。甾体类药物的发现及合成是近半个世纪以来医药工业取得两大进展之一，且甾体类药物是仅次于抗生素的第二大类药物[1-2]。已报道的文献中玉蜀黍赤霉(Gibberella zeae)[3]、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)[3]、亚麻刺盘孢(Colletotrichum lini)[4]能将去氢表雄酮转化为三羟基雄甾烯酮，随着甾体药物的发展，甾体药物已经成为医疗领域中不可缺少的一部分，甾体类药物的发现在医药工业上具有里程碑的意义，微生物羟化技术的发展不仅促进了甾体药物的发展，同时也使得药物代谢水平得到了更大的提高，根据国外报道，Avramova T[5]等将Tween-80应用到Rhodococus sp.对雄烯二酮9alpha;羟化反应中,反应结果发现其可使产物提高近五倍.除此之外,Romano[4]等研究证实了Colletotrichum lini可以同时是去氢表雄酮发生双羟化反应。而在国内，由于我国进入甾体市场比较晚，科研发展相对落后，而甾体药物结构十分复杂，以至于我国甾体类药物的生产种类比较单一，但是在用静息培养羟化DHEA也取得了一定的成就。易奎星[6]等通过新月弯孢霉的静息细胞制备氢化可的松，陈长华[7]等利用黑根霉的静息细胞研究利用不同的添加物，对于16alpha;,17alpha;-环氧孕酮C11位羟化的影响，通过一系列的研究，都使转化率有了明显的提高。
对于甾体类化合物羟化反应过程中，存在着很多的限制因素，从而导致产物的率不高等，菌株的羟化能力低，使得羟化酶的表达量少，而细胞的通透性也将决定了反应效率，底物溶解度不高使得产物得率较低，另外一个原因是底物或者产物对菌株存在一定的影响，抑制了菌体，从而使得反应的效果不好。
屈螺酮是合成口服避孕药的重要成分，而将去氢表雄酮羟化则是合成屈螺酮重要的生物转化过程。传统采用化学合成方法，经过一系列复杂的化学反应合成的，合成的羟化去氢表雄酮的方法目前主要用边发酵边转化的方式，但因转化过程较为复杂，常规的方法无法保证转化过程的稳定性，使生产指标波动较大，且甾体类药物在水中的溶解度较低，从而造成了反应困难，底物转化率低以及产物得率不高等现象。化学合成法是最早用来获得甾体类化合物的，但是化学合成法的流程十分的复杂，所用的化学试剂较多，成本较高，所带来的经济效益比较低，而微生物转化法可以缩短反应步骤，使工艺变得简单化，降低了有机溶剂对环境的危害和污染，而细菌和霉菌都可以用于微生物的转化，目前被报道的菌株中Colletotrichum lini是能够将DHEA催化成7alpha;,15alpha;-diOH-DHEA活性最强的菌株，但是全细胞转化法副产物较多，而已易受培养基的影响，人们逐渐偏向于静息细胞羟化DHEA。目前，利用微生物转化法对DHEA进行羟化已经成为常规使用的方式，生物转化法可包含生长细胞转化法、静息细胞培养法。生长细胞转化法的优点是生产工艺简单，实验所需时间较短，且效率较高，其缺点是随着转化时间的变化，时间越长，目的产物降解越多，且转化过程中会产生一定的副产物，使产品的分离提取过程较为困难。而静息细胞得是一类进行有氧非生长状态的细胞，一般是将培养好的细胞悬浮于缺少氮源的缓冲液体系中，直接添加底物进行反应，静息细胞培养法能使副产物减少，条件较为温和，产物得率提高，同时没有了培养基成分的影响，使后续产物处理分离较为简单，减少了实验成本，但其制备静息细胞延长了反应的时间，综上所述，可发现如何提高产物得率，降低杂质的影响等因素是羟化DHEA过程中不可缺少的部分，本实验将会以其作为研究对象，分析两种工艺的优劣，为生长细胞转化法及静息培养法联合工艺提供理论参考。
培养基：
1）斜面固体培养基（g/L）：马铃薯 200， 葡萄糖 20， 琼脂 20 ，自然PH，121℃灭菌，30min。
2）种子培养基：葡萄糖 15，酵母粉 15，玉米浆 3，豆饼粉 10，自然PH，121℃，灭菌30min。
3）发酵培养基（g/L）：葡萄糖 20，硝酸钠 2，磷酸氢二钾 1 ，磷酸二氢钾 0.5，硫酸镁 0.01 ，玉米浆 10，自然PH，121℃，灭菌30min。
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