开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）
一、研究背景
迄今为止，人们已经研究出了多种原核、真核表达系统用于生产重组蛋白。与其它表达系统相比，大肠杆菌表达系统具有繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定等优势，并且被美国FDA批准为安全的基因工程受体生物，因而被广泛使用。但是，当前的大肠杆菌表达系统仍存在一些缺点，包括易形成不溶性无活性的包涵体、内毒素残留、包涵体蛋白纯化工艺复杂等。
大肠杆菌为革兰氏阴性菌，它的内膜和外膜将其隔成三个区域：胞内、胞外和周质空间。相较于胞内表达，大肠杆菌将重组蛋白分泌至胞外具有许多优势，包括避免重组蛋白在胞内聚集形成包涵体、免受蛋白酶降解、利于蛋白正确折叠、简化纯化工艺等。通常重组蛋白从大肠杆菌胞内转运到胞外需要跨过内膜和外膜。内膜的跨越可以通过在重组蛋白N端融合一段疏水信号肽或者定位于周质空间的蛋白如硫氧还蛋白（Trx）实现。但是由于大肠杆菌缺乏天然的胞外分泌机制，重组蛋白仍无法有效通过细胞外膜。为了克服这个问题，科学家提出了多种策略旨在使重组蛋白释放到培养基中，包括融合表达能直接分泌到胞外的蛋白片段、融合表达外膜蛋白、共表达kil基因等。其中，构建大肠杆菌胞外分泌表达菌株是一种有效方法。这种方法需要首先将蛋白通过在N端融合一段信号序列分泌到周质空间，由于膜结构的缺陷，外膜通透性增加，重组蛋白分泌到胞外。这种方法具有非特异性，适用于许多周质表达的蛋白。但仍存在的一种潜在的缺点，即膜突变型菌株细胞生长的影响。研究表明，只要突变靶点选择得当，可以排除这种隐患。
二、研究目的和意义
本课题拟构建包含不同信号肽的周质表达系统，实现聚多肽融合FGF21蛋白的周质表达，优化表达体系，旨在证实聚多肽融合蛋白能够实现跨膜分泌表达。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术特异性敲除细胞外膜或细胞壁相关基因，筛选获得多个单基因突变的大肠杆菌菌株，为大肠杆菌胞外生产外源蛋白提供遗传性质稳定的表达系统，得到高表达的胞外分泌菌株。
三、实验内容
1. 大肠杆菌周质表达载体的构建及筛选
1.1信号肽序列筛选、设计及改造
1.2聚多肽融合FGF21周质表达载体的构建
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