课题背景:
自噬是一种溶酶体介导的细胞降解降解过程[1]。根据被降解底物到达溶酶体内腔的不同途径，哺乳动物细胞中的自噬可以划分为三类：大自噬、小自噬以及分子伴侣介导的自噬。在大自噬中，被降解的物质被一种分离膜隔离形成自噬体，接着自噬体与溶酶体融合使被隔离的物质被水解酶降解。小自噬降解底物的方式与大自噬相同，但在小自噬中，溶酶体自身形成分离膜包裹即将被降解的底物。在自噬的第三种形式——分子伴侣介导的自噬中，一种可溶性的伴侣蛋白特异性识别细胞质中某种可溶性蛋白形成分子伴侣—底物复合物，紧接着该复合物与溶酶体膜上的一种受体选择性结合，该受体则介导降解底物运输到内质网内腔中这一过程[2]。在本课题研究中，我们主要关注大自噬（下文简称为自噬）。
自噬可以被划分为至少四个步骤：自噬的诱导、自噬体的形成，自噬体锚定在溶酶体上并与溶酶体融合以及自噬小体降解[3]。自噬是一种在所有真核生物细胞中普遍存在的、进化上保守的过程[5]，并具有许多生理功能。一方面，自噬具有本底水平的活性，可以更新长寿命蛋白，还能去除多余的或受损的细胞器。后一种功能也许与自噬在寿命延长中的作用有关[6]。另一方面，自噬可以作为一种针对多种胁迫条件（例如营养限制、热以及氧化胁迫）的细胞应答而被诱导。自噬还在细胞发育和分化中发挥作用[7]。此外，自噬还涉及多种疾病[7-8]，包括癌症和神经退行性疾病变，如阿尔兹海默症、帕金森症和亨廷顿症。另外，自噬在固有及适应性免疫方面发挥多种多种作用[10]。例如，自噬能够消除入侵的病原体，包括病毒、寄生虫和细菌；自噬还促进微生物（以及自身）抗原的MHC II类提呈。最后，缺乏细胞凋亡时，自噬还可以参与一种与细胞凋亡截然不同的程序性细胞死亡（II型）[11]。综上，选择性地激活或抑制组织特异的自噬功能在疾病治疗领域上具有极高的价值[2]。
在酵母中进行的遗传筛选使我们对自噬的分子机制有了较深的理解。但高等真核生物和酵母的自噬有几个显著的不同：第一，在高等真核细胞中，没有证据表明有PAS（前自噬体结构）的存在，其分离膜可同时从多个位点中产生。第二，自噬体在与溶酶体融合之前经历了一系列成熟过程。再者，与自噬相关的不同信号途径在高等生物发育过程中得到了整合。这说明在高等真核生物细胞中，自噬的分子机制较酵母更为精细[1]。
秀丽隐杆线虫作为一种模式生物，具有以下几点优势：首先，秀丽隐杆线虫是一种相当简单的动物，其中雌雄同体只有959个体细胞。其次，该种线虫是透明的，可以自我繁殖，非常容易培养并具有一个短的生殖周期（大约三天）[1]。因而，被广泛的应用于生命科学领域的研究，如利用线虫研究细胞凋亡，RNA干扰等，并取得了系列的突破性进展。因此，本课题组在前期研究中，建立了以秀丽隐杆线虫为遗传模型的细胞自噬研究体系，并鉴定了多个高等生物特异的自噬基因，如epg-2,3,4,5，cup-5等，以及一些自噬基因的远系同源基因，如epg-1,7,8,9等，并深入阐明其在自噬过程中的功能与分子机制。
在高等真核生物中，不同的组织细胞在组成形态和功能上也都存在种种不同。因此，我们得出了以下疑问：在高等真核细胞进化的过程中，自噬为了适应不同的胞内环境，其是否具有组织特异性？是否存在有组织特异性的自噬基因？若要筛选出有组织特异性的自噬基因，我们需要建立相应的筛选模型。秀丽隐杆线虫胚胎发育的过程中，自噬选择性地清除多种蛋白聚集体，其中包括了SQSTM1/p62同源物SQST-1，因此我们拟利用SQST-1::GFP为报告基团，用组织特异性的启动子来驱动SQST-1::GFP的表达，从而构建组织特异性的SQST-1：：GFP转基因线虫株，并用于遗传筛选。
课题目的与采用的研究手段：
为了建立一种在肌肉组织特异性表达SQST-1::GFP的秀丽隐杆线虫模型用于遗传筛选，我们需要进行以下工作：
- 寻找在线虫肌肉组织特异性表达的启动子（以下简写为Pmuscle）；
- 构建Pmuscle：：sqst-1：：gfp报告基因质粒；
- 通过显微注射的方法，将报告基因质粒注射到unc-76的线虫中（unc-76为标记基因，unc-76质粒注射入unc-76 突变体，使恢复表型），观察后代F2。如果某一盘发现有野生型的虫子，则认为外源基因表达了。荧光显微镜下观察表达情况，若表达较弱，再打NAC RNAi(NAC RNAi可以引起肌肉细胞自噬缺陷），抑制自噬活性，若有明显累积，则可以进行下一步实验；
- gamma;-射线照射法整合外源基因。
参考文献：
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