一、文献综述
在肿瘤的治疗中，传统的给药方式靶向性较低，不良反应严重，使用受到限制，因此寻找特定的药物靶向投递系统充满了无限的前景。叶酸受体（folate receptor FRalpha;）在人类各种上皮细胞癌包括卵巢癌，肺癌，肾癌，间皮瘤和和脑瘤中高度表达，而在大多正常组织中几乎不表达[1]。因此叶酸受体抗体偶联药物表现出较理想的优势。
叶酸受体3 种亚型：FRalpha;、FRbeta;、FRgamma;。在正常生理状态下，这三种异构体在不同组织的表达水平不同[2]。目前研究最为透彻的是叶酸受体alpha;（FRalpha;），其分子量为38KD，是一种基磷脂酰肌醇锚定的糖蛋白, 对叶酸及其衍生物具有很强的结合亲和力[3]。通过细胞膜的内吞作用将叶酸摄入胞内。FRalpha;的氨基酸序列中的E39、E40、E41这几个区，能有效地激活肿瘤相关淋巴细胞CTL 的活性，产生肿瘤免疫应答反应[4]。研究表明：FRalpha;既可以通过从血液大量摄取叶酸来满足肿瘤细胞生长的需要，又可以通过细胞信号通路来影响细胞的增生。Bagnoli[5]发现：一种肿瘤抑制基因小窝蛋白的缺失表达与FRalpha;表达水平呈负相关性，说明FRalpha; 能与细胞信号蛋白相互作用，调节细胞生长。基于FRalpha;在肿瘤中的高效表达，故可以根据FRalpha;设计靶向性的抗肿瘤药物系统。
单链抗体是通过一条连接肽将抗体的轻链可变区和重链可变区基因首尾连接所形成的单一肽链，此肽段分子量仅为全抗体的1/6，通过正确的空间折叠，形成具有抗原结合活性的肽段，是保持亲本高亲和性和特异性的功能性抗体片段。具有良好的柔韧性的肽连接序列，不会影响轻、重链可变区的二级结构及空间构型。单链抗体用于靶向治疗的优点[6]：①基因结构相对简单，构建表达方便，利于进一步进行基因工程操作；②分子量小，穿透力强，容易穿透肿瘤血管屏障到达靶组织；半衰期短，特别容易在血液循环中清除，在非靶组织内存留的时间很短，大大降低了其在正常组织的分布；③只有可变区，免疫原性低，用于人体治疗时不易产生抗异种蛋白免疫反应；④没有抗体的Fc段，因此不会与Fc受体阳性细胞结合，大大减少了体内的非特异性杀伤。因此，单链抗体不仅可在肿瘤的靶向诊断和治疗方面发挥巨大的作用，而且越来越成为基因工程抗体领域的研究热点。
抗体偶联药物（antibody drug conjugates ，ADCs）是通过化学键将毒性小分子与抗体偶联的靶向抗肿瘤药物，其充分利用了抗体的特异性和毒性小分子的高抗肿瘤活性，达到了高效低毒的目的。抗体、连接物以及毒性小分子是 ADCs的3个重要组成部分，抗肿瘤毒性小分子可通过抑制DNA、RNA、蛋白合成、细胞分裂等对肿瘤细胞进行杀伤，具有高效的抗肿瘤活性，然而毒性小分子往往对肿瘤和正常细胞缺乏选择性，在杀伤肿瘤细胞的同时，对正常细胞也有较大不良反应[7]。临床治疗中，将化疗药物与抗体偶联形成的抗体偶联药物可以靶向性作用于肿瘤细胞，显示了高效的治疗效应[8-10]。
实验室从全人源噬菌体抗体库中筛选出能够结合FRalpha;的单链抗体，并获得了其基因序列，构建工程菌，表达提取分离纯化靶向FRalpha;的单链抗体。课题选用蒽环类药物阿霉素（Doxorubicin， DOX）作为偶联的药物，DOX是一种蒽环类拓扑异构酶抑制剂，其临床应用广泛、药效明确, 属于周期非特异性药物, DOX通过嵌入DNA的碱基对干扰DNA复制和RNA转录来发挥抗肿瘤作用，其抗瘤谱广，临床上用于治各种肿瘤如肺癌、乳腺癌、胶质瘤等[11-13]。DOX特异性识别能力低，对正常细胞组织也有伤害，静脉注射短时间内会引起恶心、骨髓抑制、呕吐等急性毒性[14]。
对于抗肿瘤药物DOX，顺式乌头酸酐（cis-aconitic anhydride）是一种很有前景的前药设计的连接剂[15]。顺式乌头酸酐是一种pH敏感性材料。正常组织的pＨ—般为7.4，而肿瘤微环境呈现弱酸性，ｐＨ介于6.0-4.5之间，采用pH敏感的材料，实现药物在肿瘤酸性微环境下迅速释放[16,17]。因此，我们可以制备酸响应小分子CAD（cis-aconitic anhydride-doxorubicin）与抗体连接，从而实现DOX的靶向给药。
因此，本课题的目的是制备叶酸受体alpha;单链抗体的偶联药物，从而降低DOX对正常细胞的杀伤作用。
参考文献
1、许玲. 叶酸靶向IgG偶联阿霉素的制备及体外抗肿瘤活性研究[D]. 华中科技大学, 2012.
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